基因組學與系統(tǒng)毒理學

毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學(ToxicogenomicsandSystemsToxicology)王安（Ph.D，副教授）Mailaddress：csuwang@；walwry@163.comPhonenumber十章10*1【主要內容】

概述

毒理基因組學研究的技術平臺

毒理基因組學研究內容及應用

從毒理基因組學到系統(tǒng)毒理學毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*2

掌握毒理基因組學含義，熟悉人類基因組計劃的主要研究內容；

熟悉毒理基因組學研究的技術平臺；

了解毒理基因組學研究內容及應用；【目的要求】毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*3第一節(jié)概述毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*4不同人種之間頭發(fā)、膚色、眼睛、鼻子等不同基因差異CaucasianNegroAfricanAmericanMongoloid毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*5基因（Gene）？是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列。

攜帶有遺傳信息的DNA序列，是具有遺傳效應的DNA分子片段；

是控制性狀的基本遺傳單位，通過指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，控制生物個體的性狀表現(xiàn)。AgeneisasetofsegmentsofnucleicacidthatcontainstheinformationnecessarytoproduceafunctionalRNAproductinacontrolledmanner.Theycontainregulatoryregionsdictatingunderwhatconditionsthisproductismade,transcribedregionsdictatingthesequenceoftheRNAproduct,and/orotherfunctionalsequenceregions.Thephysicaldevelopmentandphenotypeoforganismscanbethoughtofasaproductofgenesinteractingwitheachotherandwiththeenvironment，andgenescanbeconsideredasunitsofinheritance.毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*6一般的定義是單倍體細胞中的全套染色體為一個基因組，或是單倍體細胞中的全部基因為一個基因組。基因組（Genome）基因組測序的結果發(fā)現(xiàn)基因編碼序列只占整個基因組序列的很小一部分。因此，基因組應該是單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子。更確切的說，核基因組是單倍體細胞核內的全部DNA分子；線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部DNA分子；葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部DNA分子。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*7人類基因組研究大事記1860至1870年，孟德爾根據豌豆雜交實驗提出遺傳因子概念，總結出孟德爾遺傳定律。1944年，艾弗里、麥克勞德和麥卡蒂3位美國科學家分離出細菌的DNA，發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳物質的分子

1953年,美國人沃森和英國人克里克通過實驗提出了DNA分子的雙螺旋模型1969年,美國科學家夏皮羅分離出第一個基因("乳糖操縱子")。1990年10月，人類基因組計劃在美國正式啟動。1984年卡瑞·繆里斯博士等發(fā)明大規(guī)模復制DNA的技術-PCR技術。1977年，美國和英國科學家開發(fā)出DNA測序的方法。1909年，丹麥植物學家和遺傳學家約翰遜首次提出“基因”的名詞，用以表達孟德爾的遺傳因子概念。摩爾根1926年發(fā)表了《基因論》，建立了基因學說，奠定細胞遺傳學的基礎。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*8人類基因組計劃（HGP）人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)是由美國科學家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。這一計劃旨在為30多億個堿基對構成的人類基因組精確測序，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一預算達30億美元的人類基因組計劃（各國所承擔工作比例約為美國54%，英國33%，日本7%，法國2.8%，德國2.2%，中國1%）。按照這個計劃的設想，在2005年，要把人體內約10萬個基因的密碼全部解開，同時繪制出人類基因的譜圖。換句話說，就是要揭開組成人體4萬個基因的30億個堿基對的秘密。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*9人類基因組計劃三大科學計劃曼哈頓原子彈計劃阿波羅計劃HGP目的解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律、認識種屬之間和個體之間存在差異的起因、認識疾病產生的機制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學依據。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*10HGP的主要任務是人類的DNA測序，包括四張譜圖。

1.建立遺傳圖：利用染色體上基因交換頻率，推斷基因之間的遺傳距離，根據點測交實驗確定各個基因的相互位置和排列順序，繪制基因連鎖圖。

2.建立物理圖：用限制酶將染色體切割成若干片段，利用互補原理通過分子雜交法，以一小段DNA序列作為標記，分析標記間的距離并確定各個片段在染色體上的實際排列順序。

3.序列圖譜（DNA序列測定）：DNA序列分析技術是一個包括制備DNA片段化及堿基分析、DNA信息翻譯的多階段的過程。通過測序得到基因組的序列圖譜（核心的工作）。

4.基因圖譜：是在識別基因組所包含的蛋白質編碼序列的基礎上繪制的結合有關基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。主要內容毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*111997年美國國立環(huán)境衛(wèi)生科學研究所（NIEHS）環(huán)境基因組計劃（EnvironmentalGenomeProject，EGP）主要目標：推進有重要功能意義的環(huán)境應答基因的多態(tài)性研究，確定其引起環(huán)境暴露致病危險性差異的遺傳因素，以開展和推動環(huán)境-基因相互作用對疾病發(fā)生影響的人群流行病學研究為最終目的毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*12毒理基因組學（toxicogenomics）研究生物體的整個基因組如何對環(huán)境有害因素發(fā)生反應的一門新興學科。

化學因素（化學物，混合化學物等）

物理因素（電離與非電離輻射，噪聲，異常氣溫等）

生物因素（細菌，病毒等）研究基因組與化學毒物間的交互作用及其方式的學科稱為毒物基因組學。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*13毒理基因組學研究計劃（ToxicogenomicsResearchProgram，TRP）研究內容基因組水平的效應基因的RNA表達（轉錄組學）蛋白產物表達（蛋白組學）代謝譜的改變（代謝組學）遺傳多態(tài)性生物信息學利用人類基因組的資料，幫助篩選和鑒別潛在的環(huán)境毒物，并在基因組水平上闡明毒作用發(fā)生的機制。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*14TRP研究目標確定某種有害因素的反應基因（信號基因）用于毒理學和相關疾病的研究建立全基因組與蛋白質組毒性反應知識庫，并在此基礎上開辟以芯片技術和生物信息技術為特征的數(shù)字毒理學（Digitizedtoxicology)。從傳統(tǒng)的遺傳毒性檢測方法基因群檢測方法顯著提高遺傳損傷檢測水平和降低檢測的閾值毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*152000年，美國環(huán)境衛(wèi)生科學研究所（NIEHS）國家毒理基因組學中心（NationalCenterforToxicogenomics，NCT）的主要任務：

促進基因和蛋白表達技術在毒理學中的應用

促進人類環(huán)境暴露和疾病易感性關系的研究

確定暴露和毒效應的生物標志

推進暴露與生物學反應關系的計算和處理方法

建立毒理基因組學公用數(shù)據庫。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*162000年6月26日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國科學家宣布人類基因組序列圖繪制成功，已完成的序列圖覆蓋人類基因組所含基因區(qū)域的99％，精確率達到99.99%?；蚪M時代后基因組時代毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*17后基因組時代（post-genomeera）人類后基因組計劃--對基因組生物學功能的研究和應用序列（結構）基因組學功能基因組學功能基因組學生物信息學比較基因組學蛋白質組學結構基因組學整體生物學DNA芯片藥物基因組學基因敲除毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*18毒理基因組學面臨的基本挑戰(zhàn)高通量篩選系統(tǒng)如微陣列（芯片技術）計算機技術

如何獲取大規(guī)模生物學數(shù)據包括基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組

的表達數(shù)據對獲取的大量信息進行及時而合理的處理

如DNA微陣列技術的基因

表達數(shù)據；還有經典的

毒理學實驗數(shù)據毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*19毒理基因組學研究的技術平臺第二節(jié)毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*20一、基因組學與轉錄組學技術平臺（一）差異顯示反轉錄PCR技術差異顯示反轉錄PCR（DDRT-PCR）技術是以分子生物學應用最廣泛的兩種技術—PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎?；驹恚菏且砸粚毎ɑ蚪M織）的總RNA反轉錄而成的cDNA為模板，利用PCR的高效擴增，通過5′端和3′端引物的合理設計和組合，將細胞（或組織）中表達的約15000種基因片段直接顯示在DNA測序膠上，從而找出其表達有差異的cDNA片斷。優(yōu)點：DDRT-PCR具有周期短，功能多，靈敏度高，所需RNA量少和重復性高等。缺點：DDRT-PCR技術假陽性率高、凝膠中單條cDNA帶成分不均一、一些低拷貝數(shù)mRNA不能有效呈現(xiàn)等。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*21（二）基因表達序列分析(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)SAGE的理論依據是：來自cDNA3′端特定位置的一段9-11bp長的序列能夠區(qū)分基因組中95％的基因。這一段基因特異的序列被稱為標簽(SAGEtag)。通過對cDNA制備SAGE標簽并將這些標簽串聯(lián)起來，然后對其進行測定。SAGE應用的前提條件：GenBank中必須有足夠的某一物種的DNA序列信息，尤其是表達序列標簽(expressedsequencetag，EST)的序列資料。

各SAGE所代表的基因在特定組織中是否表達；

根據各SAGE標簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達豐度的指標。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*22（三）微陣列分析DNA微陣列(microarrayassay)或DNA芯片(DNAchip)技術，可以在同時定量的分析大量的基因表達，具有快速、精確、低成本之分析檢驗能力。基因芯片通過微加工技術，將數(shù)千或數(shù)萬個特定序列的DNA片段（基因探針）有規(guī)律地排列固定于2c㎡的硅片、玻片等支持物上，構成一個二維的DNA探針陣列，因與電子計算機上的電子芯片十分相似所以被稱為基因芯片。使用的基本硬件，是一塊帶有DNA微陣列（micorarray）的特殊玻璃片或硅芯片片，在數(shù)平方厘米之面積上布放數(shù)千或數(shù)萬個核寡聚核苷酸片段或cDNA探針(cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸)，按一定順序以矩陣方式排列在載玻片大小的塑料或玻璃板上，其敏感性可達1～5個拷貝mRNA/細胞。與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可獲得樣品的遺傳信息。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*23基因表達的測定：先將受試動物染毒，其靶器官或細胞與毒物接觸后，發(fā)生反應或被活化的基因會產生mRNA。然后將這些mRNA用核素或熒光色素標記后，加入基因芯片。在一個單個的陣列中加入兩種標記樣品進行雜交。雜交完成后，可用圖像解析顯微鏡或激光掃描顯微鏡進行探測和分析。根據發(fā)生的結合反應的情況，便可以判斷是哪些基因發(fā)生了改變。通常采用發(fā)紅色熒光的Cy3和發(fā)綠色熒光的Cy5熒光色素，分別標記實驗和對照樣品中的RNAs。由于熒光的強度和RNAs的含量間有一定的相關關系，可通過兩種熒光的相對強度變化來確定實驗組樣品中DNA表達的差異。如果再與實時PCR相結合，就可得到特定基因的定量表達信息，發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關基因等多個研究領域。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*24優(yōu)點：

靈敏度高mRNA豐度低至10萬分之一仍能被檢測出；

可同時采用幾種不同顏色的熒光染料標記探針，在同一張陣列膜進行一次雜交實驗就可分析不同樣品間基因表達的差異。缺點：

成本較高，需要特殊的信號檢測分析系統(tǒng)；

玻片上的微陣列不能重復使用。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*25（四）RNA干擾技術（RNAinterference，RNAi）將外源性雙鏈RNA導入細胞后，可產生21-23nt（nucleotide，核苷酸）長度的小分子干擾RNA（siRNA），引起與其序列同源的特異基因mRNA降解的現(xiàn)象，為轉錄后的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）在哺乳動物細胞進行RNAi實驗包括五個步驟：選取目的基因設計相應的siRNA制備siRNAsiRNA轉染哺乳動物細胞RNAi效果分析毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*26

靶siRNA序列選擇是RNAi實驗成敗的關鍵；

siRNA的制備方法：化學合成法，體外轉錄法，合成法和“雞尾酒”法；

siRNA轉染是將siRNA，siRNA表達載體或siRNA表達框架（siRNAexpressioncassettes,SECs）導入哺乳動物細胞；

RNAi的效果可從mRNA和蛋白質水平進行評價；

mRNA水平可通過Northernblot和實時定量PCR（real-timeRT-PCR）的方法；蛋白質水平可通過Westernblot、熒光免疫法、流式細胞技術和表型分析等方法檢測。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*27

染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中發(fā)生頻率大于1%。（五）單核苷酸多態(tài)性檢測（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）在基因組中搜索SNPs的最普遍的方法是將已定位的序列標簽位點（sequencetaggedsites,STS）和表達序列標簽（expressedsequencetags,EST）進行測序DNA芯片技術的應用可大規(guī)模發(fā)現(xiàn)和識別SNPs有單堿基的轉換、顛換、插入、缺失等形式在基因組中分布不均勻，隨機分布在基因組的單堿基變異，在基因編碼區(qū)估計有2×105個SNPs,稱為cSNPs（coding-regionsSNPs），與蛋白質功能有關。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*28限制性酶切片段長度多態(tài)性技術（RFLP）SNPs的檢測方法等位基因特異寡聚核苷酸雜交技術（ASO）單鏈構象多態(tài)性技術（SSCP）基因芯片技術毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*29Takeabreak毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*30二、蛋白組學技術平臺目前最常用技術路線是利用雙向凝膠電泳分離蛋白、綜合質譜和生物信息學分析技術進行鑒定雙向凝膠電泳和質譜技術是目前蛋白質組學研究的核心技術毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*31（一）雙向凝膠電泳（2-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）樣品制備原理：細胞抽提物在電泳過程中，依據蛋白質所帶電荷及分子大小而被分離。實驗成敗的關鍵要盡可能使樣品轉變?yōu)檫m合進行電聚焦的狀態(tài)，同時保持原有的電荷和等電點為盡可能多地獲得樣品中的蛋白質，可采用預分級處理方法根據蛋白質溶解性的不同進行分步順序提取，增強特定蛋白點的濃度，提高低豐度蛋白質的上樣量；預先對細胞亞結構進行分離，利用傳統(tǒng)梯度離心法分離各種細胞器，再提取蛋白進行二維電泳，建立相應的亞細胞蛋白質組數(shù)據庫毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*32電泳

梯度凝膠電泳：使用窄pH及極窄pH范圍梯度凝膠電泳，提高2-DE分辨率。適用于低豐度蛋白的檢測

膠上差示電泳（differentialin-gelelectrophoresis,DIGE）將不同樣品蛋白質標上不同的熒光染料，在同一塊膠上進行電泳分離，用熒光掃描儀進行識別。該方法重復性好，靈敏度高，質譜兼容等優(yōu)點。缺點不能很好顯示低豐度蛋白、疏水性膜蛋白、極酸或極堿性、極大和極小分子量蛋白；不同樣本間難以進行定量比較；費時、費力，不容易自動化；重復性差。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*33（二）生物質譜技術（biologicalmassspectrometryBMS）基本原理：使樣品分子離子化后，根據不同離子間質荷比（m/z）的差異來分離并確定相對分子質量。

基質輔助激光解吸離子質譜（metrixassistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry，MALDI）

電噴霧離子化質譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI）

表面增強激光解吸電離-飛行時間質譜（surface-enhancedlaserdesorptionionization，SELDI）結合芯片和質譜技術，將蛋白質樣品制備、生化反應和檢測分析等過程集成在芯片上進行，在數(shù)分鐘內同時分析幾百種蛋白質，樣品體積可低至0.5μl，利于微量樣本研究。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*34

多向蛋白鑒定技術（multi-dimensionalproteinidentificationtechnology，MudPIT)將蛋白質酶解后得到多肽混合物，進樣到強陽離子交換色譜柱，直接洗脫后進樣到反相液相色譜柱上，然后進行梯度洗脫，用MS/MS對分離的餾分進行鑒定。一個分析周期可檢測100多種蛋白質，適用于大規(guī)模蛋白質的分離鑒定。

同位素親和標簽（isotope-codedaffinitytag，ICAT）利用化學性質相同而質量不同的兩種同位素分子，對蛋白樣品的半胱氨酸進行標記，然后對混合的樣品進行質譜分析，通過比較質譜峰的強弱可以對蛋白質進行定量比較。具有廣泛的兼容性和高度專一性，而且適用于低豐度蛋白分析，是差異蛋白質組定量分析研究的有力工具。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*35

分子掃描技術（molecularscannertechnology）將雙向凝膠轉到涂有酶解液的膜上，在轉膜的同時進行酶切，再利用質譜掃描鑒定

抗體與蛋白質陣列技術（antibodyandproteinarraytechnologies）將雙向凝膠轉到涂有酶解液的膜上，在轉膜的同時進行酶切，再利用質譜掃描鑒定毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*36三、代謝組學技術平臺代謝組學（metabonomics/metabolomics）是研究關于生物體被擾動后其代謝產物（內源性代謝物質）種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學。代謝組學研究生物整體、器官或組織的內源性代謝物質的代謝途徑及其所受內在和外在因素的影響及隨時間變化的規(guī)律。

作為全局系統(tǒng)生物學的基礎和重要組成部分，代謝組學是以物理學基本原理為基礎的分析化學、以數(shù)學計算與建模為基礎的化學計量學和以生物化學為基礎的生命科學等學科交叉的學科。

作為基因組、轉錄組和蛋白組的“終端”，能夠更直接、更準確地反映生物體的病理生理狀態(tài)。毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*37技術路線及方法檢測和分析內源性代謝物信息技術

核磁共振（NMR）

色譜及聯(lián)用技術（GC-MS\LC-MS）

紅外光譜(IRspectrum）

毛細管電泳（CE）采樣（血樣尿樣或其他）代謝物的提取上機檢測（GC-MS\LC-MS\NMR）數(shù)據預處理（信息峰提取、識別）多元變量統(tǒng)計分析（PCA、PLS-DA、OPLS-DA）深度數(shù)據挖掘（代謝通路分析、關聯(lián)分析）毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*38（一）磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）可在一次單獨檢測中獲得生物體液中成百上千的代謝物組分信息，而無需預先確定被檢測物質的性質。所需樣品量較少，不需要復雜的樣品處理或衍生措施，且樣品還可回收用于其他分析。

氫譜（HNMR)：對含氫化學物均有響應，能完成對樣品中大多數(shù)代謝物的檢測，具有較高的靈敏度和較好的重復性。

碳譜（CNMR)：可以給出分子量在500以下的有機化學物豐富的碳骨架信息，適合檢測低分子量物質，并可為氫譜提供物質結構的補充信息，但存在靈敏度低，采樣時間長，所需樣品量大的缺點毒理基因組學與系統(tǒng)毒理學*