操縱子理論在基因工程的應(yīng)用

分子克隆載體

周俊宜fzyxzjy@126.com基因工程的表達(dá)體系操縱子理論在基因工程中的應(yīng)用目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性常用基因載體基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒

基因工程的表達(dá)體系原核生物表達(dá)體系：

大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：積累了充足經(jīng)驗(yàn)，有數(shù)不清的載體可供應(yīng)用；可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對低得多；真核生物的基因先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱為亞克?。╯ubclone），然后采用其它方式轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞上表達(dá)。缺點(diǎn)：原核生物載體構(gòu)建的重組體是無法進(jìn)入動物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)；沒有加工所需的酶系統(tǒng)；熱源、內(nèi)毒素不易除去；常會形成包涵體。

表達(dá)體系的發(fā)展

表達(dá)體載體宿主第一代原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細(xì)胞表達(dá)體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個體

基因工程的目的是使目的基因能高效表達(dá)?；虮磉_(dá)受DNA結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)因子與核酸相互辨認(rèn)、結(jié)合等組成的表達(dá)體系的調(diào)控。

基因表達(dá)調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等水平進(jìn)行基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達(dá)調(diào)控的基本理論知識，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進(jìn)行重組、改造。

操縱子理論在基因工程的應(yīng)用一、啟動子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控原核生物的轉(zhuǎn)錄單位是操縱子，操縱子包括相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列操縱子P：啟動序列O：操縱序列I：調(diào)節(jié)序列

I

POCAP調(diào)控區(qū)

ZYX結(jié)構(gòu)基因以乳糖操縱子（lacoperon）為例：誘導(dǎo)物

ZYX

I

POCAP

ZYX

I

POCAP二、強(qiáng)啟動子的構(gòu)建開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3

3

RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列TATA盒CAAT盒GC盒

增強(qiáng)子

順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動子保守序列RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合Ptac啟動子Ptrp與Plac的雜化產(chǎn)物Ptac比原來各自的活性強(qiáng)

-35區(qū)-10區(qū)Ptrp

TTGACATTAACT

共有序列

TTGACATATAAT

Ptac17

TTGACATATAAT

乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖

乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。

IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。LacZ基因編碼的乳糖苷酶

X-gal

藍(lán)色吲哚產(chǎn)物三、藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal試驗(yàn)）誘導(dǎo)物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶轉(zhuǎn)錄終止：非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止需要莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以t（termination）代表。CGGCCGCGGCCUAAUGA5’…AUACCAUUUUUUUUU…3’四、轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)的插入莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG53

35RNA-pol

五、增強(qiáng)子

轉(zhuǎn)錄起始前-30區(qū)為TATA盒，還有多種順式作用組件相互配搭成啟動子。

增強(qiáng)子遠(yuǎn)距離地、不同方向地控制啟動子的活性。增強(qiáng)子的核心序列是TGTGGAATTAG。增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)有：非特異性遠(yuǎn)距離操縱、多方向性。

酵母結(jié)構(gòu)基因的上游還有上游活化序列（upstreamactivationsequence，UAS）。目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性核糖體結(jié)合位點(diǎn)（S-D序列）mRNA有與核糖體DNA結(jié)合的位點(diǎn)S-D序列(Shine-Dalgarno)，又稱為核糖體結(jié)合點(diǎn)。

3’…ACACUAGG…5’16sRNA

UCU-C-C-U5’……AGGAPuPuUUUPuPu…AUGmRNAAGGA后的的7個Pu是核糖體小亞基的辨認(rèn)部位lF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF2,fmetfmet30S50SlF1、3mRNAGTP基因克隆時的定向插入

插入序列兩邊的酶切口不同,插入的組件不會倒裝，保證了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正確轉(zhuǎn)錄，這種構(gòu)建方式稱為定向插入。EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC19如果插入序列自身不含ATG起始密碼,或限制酶切點(diǎn)不能把讀碼框準(zhǔn)確置于ATG之后,或插入片段編碼未清楚,可在目的基因之前設(shè)保險序列:

5’…ATGNATGNATG5’…ATGNATGNATG1234565’…ATGNATGNATGXY1234565’…ATGNATGNATGZ123456能正確讀出三聯(lián)體密碼的起始序列TAAATGIIIIIIIVVIVIIIVATGIIIIIIVIIIIIIOri轉(zhuǎn)錄起始翻譯起始信號肽成熟蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)CSCSCSCS--cloningsite常規(guī)質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

Plasmidchromosome

基因載體應(yīng)具備的條件：（1）有多種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，但每種切口最好只有1個；（2）有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍(lán)白斑試驗(yàn)；（3）有一定容量；（4）有相當(dāng)?shù)某緮?shù)，即每個宿主菌可能容納的最多數(shù)。多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體1、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。4、質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。質(zhì)粒的生物學(xué)特性5、根據(jù)每個寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。

發(fā)展概況

pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。

許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成。可見其原型質(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)。

pBR322有過百個限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點(diǎn)也多達(dá)數(shù)十個，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。此外，pBR322DNA，被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ不得基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker.

476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表達(dá)半乳糖苷酶的α片段。LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動子Plac和操縱基因O。lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。三個顯著特點(diǎn)：（1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個細(xì)胞含500-700個拷貝）。（2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。（3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測序和體外突變等研究。pKO系列組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位點(diǎn)包括terr，.表達(dá)產(chǎn)物催化Gal+ATPGal-1-P+ADP以14C標(biāo)記的半乳糖作底物,檢測生成的*Gal-1-P的放射性。在Galk基因上游插入目的基因，根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算啟動子功能的強(qiáng)弱。如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強(qiáng)，則說明插入片段不存在有啟動子。λ噬菌體載體噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。侵犯細(xì)菌時，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖（圖1-5）。圖左示λ噬菌體在宿主內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，在1個菌體內(nèi)生長出100個左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細(xì)菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原（lysogen）。λ噬菌體的生活周期：