淺論左旋精氨酸對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用

淺論左旋精氨酸對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用【摘要】目的：探討左旋精氨酸(Larginine，LArg)對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用及機(jī)制。方法：建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM組)和DM4周后LArg治療組(LArg組),并以正常組作對(duì)照。觀察8周后,測(cè)定各組大鼠尿白蛋白排泄率(UAER)、血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)，光鏡觀察腎組織形態(tài)。檢測(cè)血清和腎皮質(zhì)中氧化亞氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量，測(cè)定腎臟線粒體膜電位及腫脹度。結(jié)果：與DM組相比,LArg組大鼠UAER，SCr，BUN顯著降低(),腎臟病理形態(tài)得到一定改善;血清和腎皮質(zhì)中NO及SOD含量顯著升高(,)，MDA顯著降低();腎臟線粒體膜電位顯著升高()，腫脹度趨勢(shì)增強(qiáng)。結(jié)論：左旋精氨酸對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用可能與增加NO合成，同時(shí)保護(hù)腎臟線粒體的功能有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】左旋精氨酸;糖尿病腎病;氧化亞氮;線粒體

[Abstract]Objective:ToexploretherenoprotectiveeffectofLarginineonstreptozotocininduceddiabeticratsanditspotential：DiabeticmodelswereinducedbyintraperitonealinjectionofstreptozotocinSTZinr+ats.Modelswererandomlydividedintotwogroups:DMgroup(nontreateddiabeticmodelrats)andLArggroup(diabeticmodelratstreatedwithLarginineafter4weeks).Thenormalnondiabeticratswereasthecontrolexcretionofurinaryalbuminexcretionrate(UAER),serumcreatinine(SCr)andserumureanitrogen(BUN)weredetectedafter8weeks.Morphologicalchangesofkidneywereobservedbyopticsmicroscope.Thelevelsofnitricoxide(NO)，theactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andmalondialdehyde(MDA)inserumandrenalcortexweredetected;kidneymitochondrialmembranepotentialandmitochondrialswellingweremeasuredinthedifferentgroups.Results：ComparedwithDMgroup,theexcretionofUAER,SCrandBUNinLArggroupweresignificantlydecreased(),whiletheabnormalpathologicalchangeswereimproved;thelevelsofNOandtheactivityofSODinLArggroupwerealsosignificantlyincreased(,),thelevelsofMDAweresignificantlyreduced();thekidneymitochondrialmembranepotentialwassignificantlyelevated()andmitochondrialswellingwasreinforced.Conclusion：LarginineprotectsthekidneysduringdiabeticmodelratspossiblybyincreasingthelevelsofNOandimprovingthefunctionofmitochondria.

[Keywords]Larginine;diabeticnephropathy;nitricoxide;mitochondrial

糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，至今其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。氧化應(yīng)激主要由活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)介導(dǎo)，在DN啟動(dòng)和發(fā)展過程中起著重要作用。在病理狀態(tài)下線粒體呼吸鏈發(fā)生斷裂，成為ROS生成的主要來(lái)源[1]。氧化亞氮(nitricoxide,NO)是新型的生物信息傳遞體，具有舒張血管、松弛血管平滑肌和抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖等功能，是具有生物活性的自由基。適量的NO可以清除ROS，過量的NO則抑制抗氧化系統(tǒng)使機(jī)體的過氧化損傷作用增加。而左旋精氨酸(Larginine，LArg)作為NO的生成底物，是否對(duì)糖尿病腎病腎臟線粒體有保護(hù)作用，減少ROS的生成尚未有明確報(bào)道。本文旨在探討LArg對(duì)糖尿病大鼠腎臟功能的保護(hù)作用及其可能的線粒體相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

試劑與儀器

左旋精氨酸(LArg)購(gòu)自Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、氧化亞氮(NO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。生化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海合富公司。SpectraMax190型酶標(biāo)儀(MolecularDevices);X222R型冷凍離心機(jī)(Beckman公司);Sigma1213型離心機(jī),UV2550紫外分光光度計(jì);RF25301PC型熒光分光光度計(jì)(島津公司);IKAULTRATURRAXT8型勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司);自動(dòng)生化分析儀(奧林巴斯2700);QWIN3自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)。

動(dòng)物模型的建立與分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠29只,體質(zhì)量170～210g,2～3月齡,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)20070001。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按65mg/kg一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型。注射72h后，尾靜脈采血，血糖大于mmol/L入選糖尿病模型。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為2組，糖尿病組(DM組，n=10)和LArg干預(yù)組[LArg組，LArginine原粉，生理鹽水配制，50mg/(kg·d)灌胃，n=10]，并以體質(zhì)量、鼠齡相匹配的正常大鼠作為正常對(duì)照組(NC組，n=9)。NC組與DM組以等量生理鹽水灌胃，共8周。實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠均采用標(biāo)準(zhǔn)飲食，可自由飲水，未使用降糖藥物。

標(biāo)本的收集

8周末收集各組大鼠24h尿,檢測(cè)尿白蛋白。大鼠麻醉后,腹主動(dòng)脈采血,檢測(cè)生化指標(biāo)。取出雙腎,分離包膜,左腎固定在4%的低聚甲醛中,用于組織形態(tài)學(xué)檢測(cè);右腎取腎皮質(zhì),制成10%的組織勻漿,檢測(cè)NO含量及氧化應(yīng)激指標(biāo)。

生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr);尿白蛋白測(cè)定采用免疫比濁法,并計(jì)算尿白蛋白排泄率(UAER)。NO含量采用硝酸還原酶法、SOD活性用黃嘌呤氧化酶法、MDA用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定，均按試劑盒說明書操作。

腎臟形態(tài)學(xué)觀察

腎組織經(jīng)固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切成4μm厚切片，行HE染色，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)攝片。

腎臟線粒體的制備

根據(jù)Aprille法，取各組大鼠腎臟，在預(yù)冷的分離液中剪碎，洗凈，冰浴勻漿，600g離心5min，取上清液，8800g，4℃離心10min，棄上清液，沉淀用4℃分離液洗3次，所得沉淀即為純化的線粒體，用考馬氏亮藍(lán)法測(cè)定線粒體蛋白濃度。

線粒體膜電位的測(cè)定

根據(jù)Emaus法，使用熒光染料Rh123(Rhodamine123)作為線粒體膜電位的標(biāo)記物，測(cè)定線粒體的膜電位值(Δψm)。具體測(cè)定方法各組大鼠線粒體重懸于測(cè)定緩沖液中，在25℃條件下分別與mol/LRh123共孵3min后用測(cè)定液洗2次，離心后重懸于測(cè)定緩沖液，用熒光光度計(jì)測(cè)定各組線粒體懸液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)505nm，發(fā)射波長(zhǎng)534nm。熒光強(qiáng)度下降越多，表明線粒體膜電位越低。

線粒體腫脹度的測(cè)定

腫脹程度根據(jù)線粒體懸液在波長(zhǎng)為540nm處的光密度值測(cè)定。制備的各組腎臟線粒體重懸于線粒體緩沖液中，采用1mmol/LCa2+誘導(dǎo)線粒體腫脹實(shí)驗(yàn)確定結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

大鼠的一般指標(biāo)

DM組大鼠死亡3只，LArg組死亡2只,實(shí)驗(yàn)前測(cè)大鼠血糖(mmol/L)NC組±，DM組±，LArg組±;DM組和LArg組間血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組大鼠腎功能的變化

與NC組相比，DM組和LArg組的血BUN，SCr及UAER均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(,);與DM組相比,LArg組BUN，SCr及UAER明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。見表1。表1各組大鼠血BUN，SCr，UAER變化±s

各組大鼠腎臟病理形態(tài)的觀察

光鏡HE染色顯示,與NC組相比,DM組表現(xiàn)出明顯的腎小球體積增大,系膜細(xì)胞顯著增多，基質(zhì)增生，并可見腎小管上皮細(xì)胞水腫;而LArg組與DM組比較，腎小球體積減小及系膜細(xì)胞數(shù)減少，系膜基質(zhì)輕微增生，部分小管上皮開始出現(xiàn)修復(fù)。見圖1。

各組大鼠血清及腎皮質(zhì)NO含量的比較

DM組較NC組，血清及腎皮質(zhì)NO含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義();LArg組上述指標(biāo)較DM組改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。見表2。

各組大鼠血清及腎皮質(zhì)SOD活性及MDA含量比較

DM組大鼠較NC組，血清及腎皮質(zhì)SOD活性下降，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義();LArg組上述指標(biāo)較DM組改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(,)。見表3。表2各組大鼠血清及腎皮質(zhì)NO含量變化表3各組大鼠血清及腎皮質(zhì)SOD活性及MDA含量變化

各組大鼠腎臟線粒體功能的變化

線粒體膜電位變化熒光染料Rh123負(fù)載后,各組熒光強(qiáng)度為：NC組1±，DM組±，LArg組±;與NC組相比,DM組線粒體膜電位顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，LArg組線粒體膜電位較DM組顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。

線粒體腫脹度趨勢(shì)從圖2可知，在540nm處，連續(xù)檢測(cè)線粒體懸液的D值，240s，NC組，DM組及LArg組的D值的下降值(ΔD)分別為，，。結(jié)果表明，與NC組比較，DM組腫脹度趨勢(shì)減弱，LArg組腫脹度趨勢(shì)與DM組相比增強(qiáng)。

3討論

糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展有四條經(jīng)典途徑，即多元醇通路、己糖胺旁路、晚期糖基化終末產(chǎn)物、蛋白激酶C途徑。Brownlee提出線粒體電子傳遞呼吸鏈上的ROS產(chǎn)生過多可以激活四條途徑，而四條途徑的激活又會(huì)促進(jìn)自由基的生成，彼此形成惡性循環(huán)，加速慢性并發(fā)癥的進(jìn)展。

ROS是生物體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的活性產(chǎn)物,MDA為ROS作用脂質(zhì)的多不飽和脂肪酸形成的重要產(chǎn)物，MDA的量可反映機(jī)體自由基的含量和脂質(zhì)過氧化程度。SOD為體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活力可反映機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力。線粒體不僅是ROS產(chǎn)生的主要部位，而且是ROS攻擊的首要靶點(diǎn)。研究報(bào)道，線粒體膜電位的變化,體外高鈣誘導(dǎo)線粒體腫脹模型可用于線粒體功能的檢測(cè)[9,10]。

在本實(shí)驗(yàn)8周時(shí)，與正常組相比，DM組大鼠血BUN，SCr，UAER均明顯升高，表明腎臟功能明顯受損。DM組大鼠MDA含量升高，間接表明ROS生成增多;SOD活性顯著降低,腎組織抗氧化防御能力受損;腎臟線粒體膜電位明顯降低，線粒體腫脹度趨勢(shì)明顯減弱，表明高糖已導(dǎo)致線粒體發(fā)生損傷。ROS生成增多與線粒體損傷已經(jīng)形成惡性循環(huán)。

糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與NO密切相關(guān)。NO又稱內(nèi)皮源性舒張因子，它以LArg為底物。糖尿病腎病早期表現(xiàn)為腎小球內(nèi)高血壓、高灌注、高濾過，進(jìn)而出現(xiàn)腎小球毛細(xì)血管襻基底膜增厚和系膜基質(zhì)增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化。早期NO升高參與了腎小球高灌注、高濾過的DN發(fā)病機(jī)制，早期使用LArg，NO生成增加，腎臟功能的受損加速。后期NO出現(xiàn)下降趨勢(shì)，加速了腎小球基底膜和系膜的增生，促進(jìn)了糖尿病腎小球硬化的形成。糖尿病大鼠模型建立4周時(shí)，NO則開始出現(xiàn)下降，此時(shí)補(bǔ)充LArg，對(duì)腎臟有保護(hù)作用[11]。以此為依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)于糖尿病大鼠病程4周時(shí)給予LArg干預(yù)，作用4周后，與DM組相比，腎組織病理形態(tài)得到改善;生化檢測(cè)BUN、SCr、UAER降低，腎臟功能出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，血清及腎皮質(zhì)中NO水平有顯著的升高，與先前研究結(jié)果基本一致[11]。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MDA含量顯著下降,間接表明ROS生成減少;SOD活性顯著升高,腎組織抗氧化防御能力得到提高;腎臟線粒體膜電位增加，線粒體腫脹度趨勢(shì)增強(qiáng)，線粒體功能得到一定程度的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)在一定程度上證實(shí)了LArg作為NO合成的前體，小劑量NO的補(bǔ)充同時(shí)可以減少ROS的生成，改善糖尿病大鼠腎組織線粒體功能，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展，為L(zhǎng)Arg對(duì)糖尿病腎病腎保護(hù)機(jī)制的研究提供了新的角度，對(duì)以后的臨床試驗(yàn)有一定的參考價(jià)值。

(本文圖1見彩色插圖)

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