柴胡疏肝散對抑郁模型大鼠行為學(xué)及bdnf及其受體rkb表達的影響

柴胡疏肝散對抑郁模型大鼠行為學(xué)及bdnf及其受體rkb表達的影響

抑郁是心境障礙，病因復(fù)雜。近年來,隨著生活節(jié)奏的加快,人們生活壓力明顯增大,普通人群中抑郁癥年發(fā)病率約為200/10萬,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。調(diào)查表明,抑郁癥居我國當(dāng)前精神疾病類首位。抑郁癥屬于中醫(yī)學(xué)“郁病”范疇,中醫(yī)證候臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示,肝郁氣滯證為抑郁癥最常見的證候類型,居各證之首。本實驗研究柴胡疏肝散及其拆方對抑郁癥模型大鼠行為學(xué)及海馬、杏仁核、額葉皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneurophicfactor,BDNF)及其受體酪氨酸激酶受體B(tyrosinekinasereceptorB,TrkB)的影響,并探討其抗抑郁機制。材料和方法1實驗動物部:scx湘成年SD大鼠60只,2～3月齡,雄性,體重180～200g,由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供,動物許可證號:SCXX(湘)4343232。按隨機數(shù)字表法將實驗動物分為:正常對照組(正常組)、模型對照組(模型組)、柴胡疏肝散干預(yù)組(中藥組)、拆方干預(yù)Ⅰ組(拆方Ⅰ組)、拆方干預(yù)Ⅱ組(拆方Ⅱ組)及氟西汀對照組(西藥組),每組10只。2藥材、藥品與膠囊柴胡疏肝散處方:柴胡9g陳皮9g川芎9g香附9g枳殼9g白芍15g甘草5g;拆方Ⅰ組處方(疏肝理氣):柴胡9g陳皮9g香附9g枳殼9g;拆方Ⅱ組處方(活血柔肝):川芎9g白芍15g甘草5g。藥材均由湘雅醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購買,飲片經(jīng)本院生藥學(xué)專業(yè)副教授雷鵬鑒定,符合中華人民共和國藥典(Ⅰ部)要求,全方及拆方分別按照比例稱重、混合,首次煎煮:生藥與水按1∶8(g/mL)比例,煎煮之前浸泡30min,煮沸后繼續(xù)煎煮30min,然后8層紗布過濾;再次以1∶6(g/mL)比例重復(fù)煎煮1次。將兩次煎出濾液合并,60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,凍干,每克含生藥8g,凍干粉密封保存于4℃冰箱內(nèi)備用,使用時100℃水溶解,使用時配置為1.0g/mL的藥液;鹽酸氟西汀膠囊由禮來公司提供,20mg/粒,批號:J20080016。用蒸餾水配成濃度為0.18mg/mL的藥液。3試劑與儀器免疫組化Ⅰ抗BDNF-博士德(BAO565)、TrkB-SANTACRVZbiotechnology(BO110)、Ⅱ抗生物素化羊抗兔IgG-BOSTER(I1107)、Ⅲ抗SABC試劑-VECTOR(PK4002),DAB顯色劑-博士德(AR1025),Trizol(Invirogen公司,51174401),SYBRGreenⅠ熒光劑-TAKARA(BK9104),PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒-PromegaA3500(292872),英國TECHNETC-512PCR儀(133540-1),Thermo冰凍切片機(CH1043B0801),瑞士RocheMolecularBiochemicalsLightCyclerSoftwareVersion3.5熒光定量PCR儀(1403694),MoticB5顯微鏡,麥克奧迪(廈門)銷售有限公司(17-TY6937)。4適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)參考KatzRJ等的方法。在自由飲食、光/暗周期為12h/12h(光照時間為6:00—18:00)、背景噪音為(40±10)db、溫度(20±3)℃條件下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。正常組每籠飼養(yǎng)5只,其余各組每籠飼養(yǎng)1只,共接受28天隨機應(yīng)激,包括電擊足底(電流強度10mA每隔1min刺激1次,每次持續(xù)10s,共30次)、冰水游泳(4℃,5min)、熱應(yīng)激(45℃,5min)、搖晃(1次/s,15min)、夾尾1min、禁水24h、禁食48h和晝夜顛倒,每日隨機給予1種刺激,使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生,以避免適應(yīng)性。5分組患者臨床等效量計算c正常組及模型組均灌服等體積蒸餾水,每天1次,連續(xù)14天;中藥組予柴胡疏肝散全方藥液[5.9g/(kg·d)]灌胃,按體重折算相當(dāng)臨床等效量;拆方Ⅰ組予柴胡疏肝散拆方I號藥液[3.3g/(kg·d)]灌胃;拆方Ⅱ組予柴胡疏肝散拆方Ⅱ號藥液[2.6g/(kg·d)]灌胃;西藥組予鹽酸氟西汀藥液[1.8mg/(kg·d)]灌胃,為70kg成人常規(guī)臨床用藥的等效量。各組灌藥時間均為慢性應(yīng)激第15天開始至造模結(jié)束當(dāng)天。6行為指標的檢測6.1體重測于實驗第0、7、14、21、28天稱重。6.2大鼠單次運動特征scearing于實驗第0、7、14、21、28天(上午7:00-9:00在安靜房間內(nèi))采用Open-field法作行為學(xué)評分。實驗所用敞箱為木質(zhì)裝置,底面大小為100cm×100cm,劃分成100(10cm×10cm)個方格,內(nèi)側(cè)面均涂黑。將大鼠放在中心方格內(nèi),固定攝像頭在敞箱上方(排除人為干擾大鼠活動),記錄大鼠3min內(nèi)中央格停留時間(timeofstayingincentralsquare),穿越格數(shù)(scoresofcrossing,四爪均進入方格才計數(shù),記為水平運動得分)、雙前肢離地(scoresofrears,記為垂直運動得分)、清潔運動計數(shù)(timeofgrooming,理毛次數(shù))。徹底清理敞箱后再進行下一只大鼠的試驗。6.3大鼠蔗糖溶液的消耗于敞箱試驗后進行,各組大鼠給予1%蔗糖溶液150mL、純水150mL,觀察各組大鼠24h內(nèi)飲用的蔗糖溶液量(蔗糖消耗量)及水消耗總量。7腦樣的采集和處理7.1腦組織切片制備每組5只大鼠,共30只大鼠水合氯醛腹腔深度麻醉后,暴露心臟,從左心室穿刺至主動脈根部,固定,剪開右心耳,快速先后灌入4℃生理鹽水250mL和4%多聚甲醛200mL,分離除去后頸部肌肉,彎鉗剔除顱骨,取腦,后固定,蔗糖內(nèi)梯度脫水。恒溫冷凍切片機連續(xù)冠狀切片,片厚25μm,出現(xiàn)相應(yīng)腦區(qū)時按12片取1片的原則依次收集腦組織切片。7.2BDNF、TrkB免疫組化采用ABC三步法,嚴格按試劑盒操作說明操作。7.3采用MoticB5顯微鏡、電腦和圖像分析軟件進行圖像采集和處理。8實時熒光定量pcr每組5只大鼠,共30只大鼠深度麻醉后,斷頭取出腦組織,冰上迅速剝離出海馬、額葉皮質(zhì)、杏仁核組織,將其轉(zhuǎn)移至凍存管中,液氮中保存。8.1trizel一步法提取總rna根據(jù)NCBIGenebank中BDNF及TrkB基因序列進行引物設(shè)計(委托上海生物工程公司)。BDNF:上游引物:5-GGGGTTAGGAGAAGTCAAGC-3,下游引物:5-TGGACAGCCACTTTGTTTCA-3;TrkB上游引物:5-CGTAGGGACACGCACTCTGA-3,下游引物:5-CCCAAGACCAGCAAGCATAA-3;β-actin:上游引物5-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3,下游引物5-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3。Trizol一步法提取總RNA(TrizolInvirogen公司)。-70℃保存(RNA檢驗A280/A260≥1.8為合格)。8.2反向轉(zhuǎn)移試驗具體步驟嚴格按照PCR操作規(guī)程以及Promega試劑盒說明合成cDNA。8.3熒光定量pcrctin反應(yīng)反應(yīng)體系實驗管:SYBR熒光染料10μL、cDNA2μL、BDNF/TrkB引物上下游各1μL、DEPC水6μL;內(nèi)參管:SYBR熒光染料10μL、Cdna2μL、β-actin上下游各1μL、DEPC水6μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性,94℃30s,1個循環(huán);PCR反應(yīng),94℃5s、60℃5s、72℃45s,40個循環(huán);60℃5s、95℃30s、40℃20s,1個循環(huán)。溫度反應(yīng)結(jié)束,由熔解曲線判定PCR反應(yīng)的特異性,根據(jù)標準曲線以及熒光曲線的CT值計算定量結(jié)果(結(jié)果用xˉ±sxˉ±s表示)。通過2-ΔΔCT計算各部位BDNF、TrkB表達,ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因,ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT模型對照組,BDNF、TrkBcDNA表達差別倍數(shù)以2-ΔΔCT表示。9統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS15.0軟件統(tǒng)計包,計量資料據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,采用方差分析完成各組均值間的配對比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組大鼠血清中banf、trkbmrna及免疫組化行為比較1各組大鼠各時間點行為學(xué)及體重比較(表1)造模前各組大鼠體重及行為學(xué)各指標比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組大鼠比較,模型組各時間點水平運動得分、垂直運動得分及理毛次數(shù)減少,中央格停留時間延長;模型組造模第14天、干預(yù)第7、14天蔗糖消耗量減少,體重減輕;模型組干預(yù)第7、14天水消耗總量減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,中、西藥組干預(yù)第7、14天各指標均有改善,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),中西藥組各指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與中藥組比較,拆方Ⅰ組干預(yù)第7、14天水平運動得分及體重降低,拆方Ⅱ組干預(yù)第7、14天水平運動得分、水消耗總量及體重降低,干預(yù)第14天垂直運動得分降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);與拆方Ⅰ組比較,拆方Ⅱ組干預(yù)第7、14天水平運動得分、水消耗總量、體重降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);與拆方Ⅱ組比較,西藥組干預(yù)第7、14天水平運動得分、蔗糖消耗量及體重增加,干預(yù)第14天垂直運動得分、理毛次數(shù)及水消耗總量增加,中央格停留時間減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。2各組大鼠BDNF、TrkBmRNA及免疫組化灰度值比較(表2,圖1)擴增曲線為S型,目的基因和內(nèi)參基因擴增曲線整體平行性較好,拐點清晰,基線平且無明顯上揚。模型組及實驗各組的目的基因和內(nèi)參基因的CT值均非常均一,中藥組海馬、額葉皮質(zhì)、杏仁核區(qū)BDNF及TrkB的mRNA表達是模型組的45.60±39.47、32.00±18.90、40.93±31.06、42.31±45.93、43.76±35.50、37.21±41.28倍。光鏡下可見BDNF及TrkB陽性細胞主要集中在海馬CA3區(qū)、杏仁核區(qū)、額葉皮質(zhì)區(qū)。與正常組比較,模型組海馬CA3區(qū)、額葉皮質(zhì)、杏仁核區(qū)BDNF及TrkB灰度值增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,中藥組、西藥組各部位各指標降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,拆方Ⅰ組除額葉TrkB無變化外,其余指標均下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。疏肝理氣養(yǎng)血藥、通肝利肝抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)情志疾病,相當(dāng)于“郁病”、“臟躁”等病證的范疇,是由氣機郁滯、臟腑功能失調(diào)而致心情抑郁,情緒不寧,胸部滿悶,脅肋脹痛等為主要臨床表現(xiàn)的一類病癥。郁病的病因有內(nèi)外兩個方面,《醫(yī)經(jīng)溯洄集·五郁論》曰:“凡病之起,多由乎郁,郁者,滯而不通之義?；蛞蛩硕鵀橛?或不因所乘而木氣自郁,皆郁也”。《證治匯補·郁證》說:“郁病雖多,皆因氣不周流,法當(dāng)順氣為先…”。柴胡疏肝散始見明·《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》,明末張介賓收入《景岳全書·古方八陣》卷五十六。原方用于“治胸脅疼痛,寒熱往來”,由“醋炒陳皮、柴胡各二錢,川芎、麩炒枳殼、芍藥各一錢半,炙甘草五分,香附一錢半”組成,具有疏肝理氣、活血止痛之功效,主治肝氣郁結(jié)所致脅肋疼痛,寒熱往來,痛經(jīng)等。方中柴胡、枳殼、香附、陳皮疏肝解郁,理氣暢中;川芎、白芍、甘草活血定痛,柔肝緩急。肝氣郁結(jié)日久,由氣分累及血分,血行不暢而致血瘀。方中配伍活血化瘀之品,能加強理氣藥行氣解郁之功效。慢性應(yīng)激可以引起人類及動物的下丘腦-腎上腺皮質(zhì)軸功能亢進,且出現(xiàn)抑郁狀態(tài)。本實驗采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激與孤養(yǎng)相結(jié)合的方法復(fù)制抑郁大鼠模型,采用行為學(xué)檢測法,結(jié)果標明各肝郁模型組大鼠體重增加減慢,糖水消耗減少,水平及垂直得分減少,中央格停留時間增加,理毛次數(shù)減少,說明抑郁模型復(fù)制成功。經(jīng)柴胡疏肝散及氟西汀治療后,上述癥狀明顯改善。BDNF是1982年由德國生物學(xué)家Barde及其同事首次從豬腦中純化并發(fā)現(xiàn)具有防止神經(jīng)元死亡功能的一種蛋白質(zhì),是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的主要成員之一。TrkB為BDNF的功能性受體,當(dāng)BDNF與TrkB結(jié)合后啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而產(chǎn)生相應(yīng)分子對神經(jīng)元的保護及促進再生作用。BDNF只有通過與TrkB的特異結(jié)合,才能啟動一系列底物磷酸化,從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。BDNF及其受體TrkB廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤以大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)域含量最高,在周圍系統(tǒng),如心、肺、骨骼肌也有低水平表達,對神經(jīng)元的生存、生長、分化具有重要影響。目前普遍認為