連錢(qián)草總黃酮提取條件優(yōu)化

連錢(qián)草總黃酮提取條件優(yōu)化

連草是嘴唇科植物的活血丹glechoma（nakai）kubre，干燥的土壤。具有潤(rùn)水、通粘液、清熱解毒、祛瘀、消腫等功效。臨床上用于治療熱淋、石淋、濕熱黃疸等疾病。連錢(qián)草莖葉含揮發(fā)油,主要含單萜烯類成分,還含有熊果酸、棕櫚酸、琥珀酸、咖啡酸、阿魏酸等。對(duì)其非揮發(fā)性成分研究很少。在我國(guó)連錢(qián)草資源十分豐富,幾乎分布于全國(guó)各省,具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前也有超聲和加熱回流提取連錢(qián)草中總黃酮的報(bào)道,但未將超聲、加熱、循環(huán)同時(shí)應(yīng)用于提取過(guò)程。本研究采用超聲循環(huán)技術(shù)對(duì)連錢(qián)草中總黃酮進(jìn)行提取,確定影響效果的主要因素和超聲提取黃酮的優(yōu)化工藝條件,為有效的提取連錢(qián)草中的總黃酮開(kāi)辟了新途徑。1藥品、化學(xué)品試劑721紫外分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠),“弘祥隆”HF-2.0B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),LD4-2A型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠),TD系列電子天平(天津市天平電子儀器有限公司)。連錢(qián)草(安徽亳州藥材公司,由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)賈天柱教授鑒定)粉碎,過(guò)80目篩;蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)0080-9705)。乙醇(AR,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠),亞硝酸鈉(AR,天津市泰興試劑廠),硝酸鋁(AR,天津市泰興試劑廠),氫氧化鈉(AR,天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司)。2方法和結(jié)果2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取120℃常壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25.0mg,置于100mL的量瓶中,加60%乙醇約60mL,密塞,超聲使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,搖勻,得蘆丁對(duì)照品溶液(0.25mg·mL-1)。2.2亞硝酸鈉溶液精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0,1,2,3,4,5mL,分別置于25mL的量瓶中,分別加水5,4,3,2,1,0mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,加10%三氯化鋁試液1mL。搖勻,放置6min,再加5%的氫氧化鈉溶液10mL,加水至刻度,搖勻,放置15min后以第1管作空白對(duì)照,在510nm測(cè)定吸光度,以吸光度值對(duì)蘆丁對(duì)照品含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程Y=6.7371X-0.0001,線性范圍0.01~0.05mg·mL-1,r=0.9999。2.3重復(fù)試驗(yàn)取5份供試品溶液0.1mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法測(cè)定總黃酮含量,結(jié)果RSD為0.9%。2.4測(cè)定一次吸光度取供試品溶液0.1mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作,并每隔5min測(cè)定一次吸光度。結(jié)果表明,20min以內(nèi)測(cè)定吸光度RSD<2%,建議定容后立即測(cè)定。2.5加樣回收試驗(yàn)取供試品溶液5份,分別加入蘆丁對(duì)照品溶液適量,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法測(cè)定總黃酮含量,平均回收率101.38%,RSD1.13%,結(jié)果表明加樣回收良好。2.6總黃酮含量的測(cè)定吸取1mL供試品溶液,然后按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值,帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出質(zhì)量濃度,然后計(jì)算各提取液中總黃酮的含量(以蘆丁計(jì)),即為得率。公式如下:總黃酮(%)=CV1V21000WV3×100%(%)=CV1V21000WV3×100%C:測(cè)定液黃酮質(zhì)量濃度(mg·mL-1);W:藥品量(g);V1:提取定容體積(mL);V2:顯色反應(yīng)定容體積(mL);V3:顯色反應(yīng)取樣液體積(mL)。2.7連錢(qián)草總黃酮含量的測(cè)定按照黃齊慧等在不同采收期對(duì)連錢(qián)草中總黃酮的影響中采用的提取方法:精密稱取60℃干燥至恒重的樣品粗粉1.0g,置玻璃燒瓶中,加入60%乙醇100mL,水浴加熱回流提取60min,提取2次,過(guò)濾,合并濾液,放置24h后,過(guò)濾,減壓回收乙醇,加蒸餾水定容至100mL,測(cè)定吸光度,計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.168%。按照祝德秋等在連錢(qián)草中總黃酮的含量測(cè)定中采用的提取方法:取連錢(qián)草粉末約0.5g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加60%乙醇60mL,密塞,稱定重量,超聲50min。放冷,密塞,再稱定重量,用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,測(cè)定吸光度,計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.027%。2.8單因素分析2.8.1提取總黃酮含量分別按照固液比1∶100;1∶50;1∶10加入相應(yīng)的連錢(qián)草和60%乙醇,在400W,1000r·min-1,室溫下進(jìn)行超聲循環(huán)提取20min,測(cè)定黃酮吸光度,并算出含量。結(jié)果總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為4.425%,3.470%,3.207%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,固液比為1∶100時(shí)提取效率最高,因此以下的單因素分析及正交實(shí)驗(yàn)均采用固液比為1∶100。2.8.2提取溶劑濃度篩選取連錢(qián)草24g,分別用梯度乙醇(95%,80%,60%,40%,20%,0%)2400mL,在400W,1000r·min-1,室溫下進(jìn)行超聲循環(huán)提取20min,測(cè)定黃酮吸光度,并算出含量。結(jié)果總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.714%,2.644%,3.772%,3.890%,3.594%,2.733%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,從既節(jié)省溶劑又高效的角度可以考慮40%乙醇,但是溶劑濃度降低大量水溶性雜質(zhì)給后續(xù)工作帶來(lái)大量麻煩。60%乙醇中黃酮含量較高,因此選擇60%乙醇進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。2.8.3測(cè)定總黃酮含量取連錢(qián)草24g,60%乙醇2400mL,在400W,1000r·min-1,室溫下進(jìn)行超聲循環(huán)提取,每10min取樣1次,測(cè)定黃酮吸光度,并算出含量。即在超聲時(shí)間為10,20,30,40,50,60min時(shí),黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為2.614%,4.306%,4.380%,4.692%,4.870%,4.900%。從實(shí)驗(yàn)可以看出,隨著時(shí)間的增加黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在增加,但50min以后增長(zhǎng)趨緩,因此選擇50min左右進(jìn)行正交試驗(yàn)。2.8.4超聲循環(huán)提取總黃酮含量的測(cè)定取連錢(qián)草24g,60%乙醇2400mL,在400W,1000r·min-1,室溫下進(jìn)行超聲循環(huán)提取,每次20min,測(cè)定黃酮吸光度,并算出含量。提取次數(shù)分別為1,2,3,4次時(shí),總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為4.128%,4.634%,4.635%,4.651%?？梢钥闯?隨著提取次數(shù)的增加黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨著增加,但是2次以后含量增長(zhǎng)緩慢,因此提取2次即可。2.8.5提取溫度溫度過(guò)高乙醇揮發(fā)嚴(yán)重,而且雜質(zhì)溶出增加;溫度過(guò)低,影響黃酮在乙醇中的溶出。因此,綜合考慮,選取20,30,40℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。2.9連錢(qián)草中總黃酮最佳提取條件的確定選取超聲功率(A)、超聲時(shí)間(B)、提取溫度(C)、溶劑體積分?jǐn)?shù)(D)為主要考察因素,各因素及水平設(shè)置如表1所示。正交實(shí)驗(yàn)采用4因素3水平正交表,即L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見(jiàn)表2。且在正交表安排的每個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用極差法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異分析,由表2可以看出連錢(qián)草中總黃酮的最佳提取條件為A3B2C3D2,即超聲功率800W,超聲時(shí)間90(45,45)min,提取溫度40℃,溶劑濃度65%。由表2中R值可以看出,4種因素對(duì)連錢(qián)草中總黃酮提取效果的影響程度依次為:提取溫度>溶劑濃度>超聲時(shí)間>超聲功率。該提取工藝最大的影響因素是提取溫度,最小的是超聲功率。2.10分散分析對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。F檢驗(yàn)結(jié)果表明,提取溫度、溶劑濃度對(duì)黃酮提取率都具有顯著的影響。2.11黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在最佳提取條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),所提取的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為5.228%,大于正交設(shè)計(jì)中的含量,所得結(jié)果正確。且所得總黃酮含量高于2.7傳統(tǒng)總黃酮提取方法及含量測(cè)定中的結(jié)果。3提取溫度和溶劑濃度對(duì)提取效果的影響本實(shí)驗(yàn)在最大吸收波長(zhǎng)的選擇上,是將蘆丁對(duì)照品、供試品溶液分別按標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法制得后,于波長(zhǎng)200~800nm掃描,均可見(jiàn)在510nm處有最大吸收,因此選擇510nm作為蘆丁和供試液測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果表明提取溫度和溶劑濃度對(duì)提取效果有極顯著的影響。分析原因認(rèn)為適度增加溫度有利于提高溶劑的溶解度,但溫度過(guò)