季銨鹽型雙子表面活性劑對(duì)緩沖溶液中白蛋白的相互作用

季銨鹽型雙子表面活性劑對(duì)緩沖溶液中白蛋白的相互作用

表面活性劑與雙親性小分子物質(zhì)之間的相互作用在食品、藥物和護(hù)理等領(lǐng)域具有重要意義。在生物化學(xué)研究中，十二烷基磺酸鈉-聚吡咯烷基膠體的電泳法確定了蛋白質(zhì)的含量，這是兩者相互作用的成功應(yīng)用。從模仿的角度來看，對(duì)蛋白質(zhì)和表面活性劑之間的相互作用的研究提供了了解蛋白質(zhì)和類脂化合物或構(gòu)合物的結(jié)合的有價(jià)值模型。血清白蛋白是哺乳動(dòng)物血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),它能夠儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)眾多的內(nèi)源性和外源性物質(zhì).由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分離、提純而常被用作模型球蛋白[3~6]來研究其與表面活性劑、金屬離子或藥物分子之間的相互作用,以期在分子水平上揭示相關(guān)生命過程的奧秘.近年來有不少血清白蛋白-表面活性劑相互作用的研究報(bào)道,主要用差示掃描量熱、熒光光譜、等溫滴定量熱、圓二色法、光散射、核磁共振等方法研究了傳統(tǒng)型表面活性劑與血清白蛋白的相互作用[7~12].雙子表面活性劑(Gemini)分子中含有兩個(gè)親水基(離子或極性基團(tuán))和兩條疏水鏈,在其親水基或靠近親水基處,由聯(lián)接基團(tuán)通過化學(xué)鍵聯(lián)接在一起.聯(lián)接基團(tuán)的介入及其化學(xué)結(jié)構(gòu)、聯(lián)接位置、剛性程度及鏈長等因素的變化,使Gemini的結(jié)構(gòu)具備多樣化的特點(diǎn),進(jìn)而對(duì)其溶液和界面等性質(zhì)產(chǎn)生影響,使之具備更加優(yōu)良的物理化學(xué)特性.因此,研究血清白蛋白與Gemini的結(jié)合規(guī)律可幫助人們更深入地了解親水-憎水等弱相互作用在生物大分子溶液中的重要性.等溫滴定量熱法(ITC)是近年來發(fā)展起來的一種在線和無損傷地研究生化熱力學(xué)和生化動(dòng)力學(xué)的重要方法,特別適應(yīng)于研究與蛋白質(zhì)等生化大分子相關(guān)的各種熱力學(xué)過程[13~15].但迄今為止,應(yīng)用該法研究表面活性劑與蛋白質(zhì)的相互作用的報(bào)道不多[16~21].本工作用等溫滴定量熱法結(jié)合圓二色法技術(shù)研究人血清白蛋白與季銨鹽雙子表面活性劑的相互作用,測定其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及熱力學(xué)函數(shù)變化,并從微觀結(jié)構(gòu)出發(fā)加以討論.重點(diǎn)考察了雙子表面活性劑疏水鏈長短對(duì)熱力學(xué)性質(zhì)變化的影響.1實(shí)驗(yàn)部分1.1n4-甲基-3-甲基苯磺酸酯h3的合成人血清白蛋白(HSA)購自Sigma公司,其溶液濃度用稱重法測定,所用分子量為66.5kDa.季銨鹽雙子表面活性劑[CnH2n+1(CH3)2NCH2CHOHCH2N(CH3)2CnH2n+1]Cl2(n=12,14),簡記為(CnN)2Cl2,參照文獻(xiàn)合成,在丙酮(AR)中重結(jié)晶提純至符合純度標(biāo)準(zhǔn)即水溶液的表面張力對(duì)表面活性劑的濃度曲線上不出現(xiàn)極小點(diǎn).實(shí)驗(yàn)用水為堿性高錳酸鉀存在下制備的二次蒸餾水.配制緩沖溶液(0.01mol·L-1,pH7.0)所用三羥甲基氨基甲烷和鹽酸均為分析純.1.2實(shí)驗(yàn)方法和過程:關(guān)于蔗糖的標(biāo)定和標(biāo)定,hsa量熱實(shí)驗(yàn)由納瓦級(jí)滴定式微量熱計(jì)(ThermalActivityMonitorTAM2277,瑞典ThermometricAB公司)完成,用隨機(jī)所帶Digitam4.1軟件控制實(shí)驗(yàn)過程并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理.通過測定蔗糖稀釋焓驗(yàn)證,該量熱計(jì)的電標(biāo)定精密度好于±1%.將表面活性劑(CnN)2Cl2溶液裝入250μLHamilton注射器,用612LundSyringePump注射泵,每次滴8.00μL于0.50mLHSA溶液中.滴定時(shí)間間隔足夠長(45min),以使信號(hào)返回基線.安瓿中攪拌器轉(zhuǎn)速固定在30r·min-1,待基線在攪拌下穩(wěn)定后啟動(dòng)實(shí)驗(yàn),以使因攪拌而產(chǎn)生的熱量被自動(dòng)扣除.實(shí)驗(yàn)溫度為(298.15±0.01)K.為扣除(CnN)2Cl2和HSA的稀釋熱,分別進(jìn)行(CnN)2Cl2溶液向緩沖溶液中滴定和緩沖溶液向HSA溶液中滴定的實(shí)驗(yàn).1.3級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的測定HSA是光學(xué)活性物質(zhì),因此可測定它的圓二色(CD)譜,從而了解其構(gòu)象.實(shí)驗(yàn)所用儀器為JascoJ-810圓二色譜儀(Japan),光源系統(tǒng)用氮?dú)獗Ｗo(hù)(流量為5L·min-1),樣品池的光徑為0.1cm.測量參數(shù):掃描速率100nm·min-1,分辨率0.1nm,響應(yīng)時(shí)間1s,累積次數(shù)3次.掃描波段為190~250nm.HSA濃度為2μmol·L-1.實(shí)驗(yàn)時(shí)向HSA中分別加入不同量的(C12N)2Cl2或(C14N)2Cl2,得到其CD譜,并用儀器附帶的楊氏法計(jì)算出二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量.2結(jié)果與討論2.1級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量圖1a,1b分別是不同濃度的(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2與2μmol·L-1HSA結(jié)合后由圓二色譜儀測得的CD譜,表1則是計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量.(C12N)2Cl2,(C14N)2-Cl2在190~250nm的波長范圍內(nèi)沒出現(xiàn)任何CD信號(hào),這表明觀察到的CD信號(hào)是由蛋白本身引起的.從表1可以看出,表面活性劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用會(huì)使蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,主要是α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變,這樣會(huì)使構(gòu)成α-螺旋的肽段伸展開來,轉(zhuǎn)化為較為松散的二級(jí)結(jié)構(gòu),預(yù)測此過程應(yīng)為焓變和熵變均增大的過程.2.2表面活性劑與hsa的結(jié)合力學(xué)2.2.1等溫滴定量熱dsc對(duì)于蛋白質(zhì)和表面活性劑之間的結(jié)合反應(yīng),其基本假設(shè)為一個(gè)蛋白質(zhì)分子具有兩類結(jié)合位點(diǎn),它們可結(jié)合相同的配體,并且同一類中的所有位點(diǎn)相同.此外,假定這兩類位點(diǎn)相互獨(dú)立,從而每一類位點(diǎn)上蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合率彼此互不依賴.基于以上假定和Langmuir結(jié)合理論可得出:式中Ni(i=1或2)是第i類位點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù),θi是第i類位點(diǎn)的結(jié)合率,Ki是第i類位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù),cL,0和cP,0分別為配體L和蛋白質(zhì)P的初始濃度,cL是配體L的游離濃度.將Eq.(1)代入Eq.(2)得:Eq.(3)是關(guān)于cL的一元三次方程,將其變形為:其中Eq.(4)有物理意義的根為其中ITC實(shí)驗(yàn)中第j次注射所得到的熱量可表示為式中Vcell是微量熱計(jì)中安瓿的體積,?θi是從第j-1次注射到第j次注射第i類結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合率,?Hi(i=1或2)是第i類位點(diǎn)的結(jié)合焓.由Eqs.(3)~(9)可知在cL,0和cP,0已知的情況下,cL是關(guān)于Ni和Ki的函數(shù),所以Eq.(10)共含有K1,K2,?H1,?H2,1N和N26個(gè)未知量,由等溫滴定量熱數(shù)據(jù)利用MATLAB6.1軟件以Qj對(duì)cL,0進(jìn)行非線性最小方差擬合,即可獲得上述六個(gè)熱力學(xué)參數(shù).2.2.2活性物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)模型見表2圖2a,圖3a分別是記錄得到的298.15K時(shí)(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2與HSA結(jié)合的ITC曲線,圖2b,圖3b分別表示由實(shí)測ITC曲線積分得到的結(jié)合反應(yīng)熱對(duì)(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2)與蛋白物質(zhì)的量之比的非線性擬合曲線.由圖可見,這兩種表面活性劑與HSA的結(jié)合均由最初的吸熱反應(yīng)轉(zhuǎn)化為放熱反應(yīng)(轉(zhuǎn)化時(shí)表面活性劑對(duì)HSA的物質(zhì)的量之比(C12N)2Cl2約為24∶1,(C14N)2Cl2約為42∶1),這與文獻(xiàn)中關(guān)于陽離子表面活性劑(DTAB)與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合的ITC曲線中所得能量轉(zhuǎn)化趨勢基本一致.由圖2b和圖3b中的曲線擬合程度可以看出,用兩類結(jié)合位點(diǎn)模型可精確地模擬本文雙子表面活性劑與HSA的結(jié)合,這兩類結(jié)合位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng):(1)表面活性劑帶正電荷的極性基團(tuán)與蛋白分子表面的氨基酸殘基的靜電相互作用,(2)表面活性劑的憎水基團(tuán)與蛋白分子疏水空腔的疏水相互作用由表2數(shù)據(jù)可見,兩類結(jié)合位點(diǎn)分別為強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)(高的K值)和弱結(jié)合位點(diǎn)(低的K值),且對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的相應(yīng)K值均比(C12N)2Cl2有所增加,這表明(C14N)2Cl2與HSA的結(jié)合力比(C12N)2Cl2與HSA的結(jié)合力增強(qiáng).值得注意的是,(C14N)2Cl2與HSA結(jié)合的弱結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(4.5)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于(C12N)2Cl2與HSA結(jié)合的弱結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(49.4),這很可能是盡管表面活性劑的疏水鏈較長時(shí)可以自卷曲,但由于HSA的疏水性空腔容積有限,而(C14N)2Cl2的疏水鏈過長,因此只有部分進(jìn)入疏水空腔內(nèi),從而導(dǎo)致弱結(jié)合平衡位點(diǎn)數(shù)的明顯減小.同樣由于這個(gè)原因,使(C14N)2Cl2的極性基團(tuán)與蛋白分子表面氨基酸殘基的結(jié)合幾率增大,導(dǎo)致其強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)比(C12N)2Cl2有所增加.2.2.3探索c4d-l-2c2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2數(shù)據(jù)可見,強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)的焓變?H1均為正值且對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的?H1比(C12N)2Cl2更正;而弱結(jié)合位點(diǎn)的焓變?H2均為負(fù)值,且對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的?H2比(C12N)2-Cl2負(fù)值減小.這是由憎水相互作用,水分子由疏水空腔向本體相的轉(zhuǎn)移,表面活性劑憎水鏈周圍“冰山結(jié)構(gòu)”的破壞及靜電相互作用等因素共同決定的.(C12N)2Cl2與(C14N)2Cl2在樣品池中的濃度變化范圍分別為1.6×10-4~3.2×10-3和7.9×10-5~1.6×10-3mol·L-1,因此除前幾滴外,兩種表面活性劑在樣品池中的濃度均超過各自的臨界膠束濃度[(C12N)2Cl2:約7.8×10-4mol·L-1;(C14N)2Cl2:約1.4×10-4mol·L-1].所以,(CnN)2Cl2與HSA的作用涉及以下過程:(a)表面活性劑的解膠束;(b)表面活性劑膠束的稀釋;(c)HSA與單分子表面活性劑的作用;(d)HSA與表面活性劑膠束的作用;(e)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化.首先,由于在ITC實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了(CnN)2Cl2溶液向緩沖溶液中滴定的實(shí)驗(yàn),(a)和(b)過程中的熱效應(yīng)在數(shù)據(jù)處理過程中均已被扣除.其次,在滴定過程中樣品池中的表面活性劑濃度大多數(shù)已超過各自的臨界膠束濃度,(c)過程的熱效應(yīng)也可以忽略不計(jì).因此熱效應(yīng)主要是由于蛋白質(zhì)與表面活性劑膠束的作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變引起的.人血清白蛋白的等電點(diǎn)為4.7,所以在pH=7.0條件下,該蛋白分子表面帶負(fù)電,表面活性劑帶正電荷的極性基團(tuán)與其相互作用應(yīng)為放熱過程,但雙子表面活性劑帶正電荷的極性基團(tuán)與蛋白分子表面的氨基酸殘基作用時(shí),極性基團(tuán)與蛋白分子表面的水化層結(jié)構(gòu)均要遭到一定程度的破壞,此為吸熱過程.并且從上述CD數(shù)據(jù)分析出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化,這也是吸熱過程.從第一類結(jié)合位點(diǎn)的焓變?yōu)檎悼芍?水化層結(jié)構(gòu)的破壞及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化所需熱量超過靜電吸引作用的放熱量.由于(C14N)2Cl2的強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)稍多,蛋白分子表面的水化層結(jié)構(gòu)破壞程度要大些,所以對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的?H1比(C12N)2Cl2更正.弱結(jié)合位點(diǎn)主要是由于表面活性劑的疏水鏈與蛋白分子疏水空腔的疏水相互作用,當(dāng)雙子表面活性劑的疏水鏈進(jìn)入蛋白分子疏水空腔時(shí),必與空腔內(nèi)表面發(fā)生疏水相互作用導(dǎo)致放出熱量;同時(shí),蛋白分子疏水空腔內(nèi)的水分子被逐出到本體水相,該過程放出少量熱量,這就使放熱現(xiàn)象更明顯些.但同時(shí)原來圍繞在表面活性劑的疏水鏈周圍的“冰山結(jié)構(gòu)”必被破壞,這是一個(gè)吸熱過程.從弱結(jié)合位點(diǎn)的?H2均為負(fù)值可知,疏水作用是弱結(jié)合位點(diǎn)的主要推動(dòng)力.同時(shí)由于(C14N)2Cl2的疏水鏈過長,只有部分進(jìn)入疏水空腔內(nèi),導(dǎo)致與疏水空腔內(nèi)表面的疏水作用及“高能水”釋放所引起的放熱量均減小,這應(yīng)是對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的?H2比(C12N)2Cl2負(fù)值減小的原因.2.2.4弱結(jié)合位點(diǎn)的熵變通過熱力學(xué)公式?G=?H-T?S和?G=-RTlnK可求出結(jié)合過程的吉布斯自由能變化和熵變(結(jié)果見表2).所求得的?G皆為絕對(duì)值較大的負(fù)值,表明所有的結(jié)合過程在本實(shí)驗(yàn)條件下都是自發(fā)的.所有結(jié)合位點(diǎn)的熵變皆為正值.熵效應(yīng)的這種變化是與主、客體的微觀結(jié)構(gòu)和所處微觀環(huán)境密切相關(guān)的.強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)相應(yīng)的熵變主要是由于表面活性劑的極性基團(tuán)和蛋白分子表面水化層結(jié)構(gòu)的破壞,以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化.弱結(jié)合位點(diǎn)的熵變則主要有以下原因:首先,由于憎水鏈插入蛋白分子的疏水空腔內(nèi)部,空腔內(nèi)水分子被驅(qū)趕回本體水相.再者,隨著憎水鏈被疏水空腔包結(jié),原來在其周圍的水分子形成的“冰山結(jié)構(gòu)”崩潰,也會(huì)引起體系的熵變?cè)龃?(C14N)2Cl2的疏水鏈過長,只有少部分進(jìn)入疏水空腔內(nèi),因此若只考慮上述兩種影響因素,對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的?S2應(yīng)小于(C12N)2Cl2.但是,(C12N)2Cl2與蛋白的疏水空腔尺寸匹配,疏水空腔和(C12N)2Cl2之間的憎水作用使表面活性劑膠束的運(yùn)動(dòng)自由度大大減小從而對(duì)應(yīng)(C12N)2Cl2的?S2減小.并且由于(C14N)2Cl2的疏水鏈有部分仍在疏水空腔外,具有較大的運(yùn)動(dòng)自由度,對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的?S2增大,正是上述多種弱相互作用的協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)(C14N)2Cl2的?S2(91.99J·mol-1·K-1)比(C12N)2Cl2(29.10J·mol-1·K-1)大出許多.3強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)298.15K下,滴定式微量熱法對(duì)HSA與兩種季銨鹽雙子表面活性劑[(CnN)2Cl2,n=12,14]相互作用的研究表明,HSA對(duì)這兩種表面活性劑有兩類結(jié)合位點(diǎn),一類是表面活性劑的極性基團(tuán)和蛋白表面的氨基酸殘基之間的靜電作用造成的強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)(有較高的結(jié)合常數(shù)),此類結(jié)合為吸熱過程;另一類是表面活性劑的憎水基團(tuán)與蛋白質(zhì)疏水空腔的疏水相互作用造成的弱結(jié)合位點(diǎn)(有較低的