五靈膠囊對(duì)脂多糖誘導(dǎo)肝損傷的調(diào)節(jié)作用

五靈膠囊對(duì)脂多糖誘導(dǎo)肝損傷的調(diào)節(jié)作用

許多研究表明，tnf-i、il-6和no都是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非生質(zhì)細(xì)胞的病理生理變化，這些細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌il-8，共同參與肝炎和肝細(xì)胞損傷的過程。預(yù)防與修復(fù)受損肝細(xì)胞是治療肝病的主要措施,五靈膠囊是治療慢性肝炎中藥復(fù)方制劑。對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子作用未見報(bào)導(dǎo)。我們?cè)谛∈篌w內(nèi)試驗(yàn)及大鼠枯否細(xì)胞(KC)體外培養(yǎng)中,觀察了五靈膠囊對(duì)肝細(xì)胞釋放細(xì)胞因子參與肝細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物昆明小鼠,BALB/c,♂,第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SC×K(軍)2002-05。1.1.2s-p超敏試驗(yàn)劑丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酯酶(ALP)試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司);兔抗-CD14、兔抗-TNF-α、兔抗-NOSⅡ(iNOS)、兔抗-NOSⅢ(eNOS)一抗(武漢博士德生物工程有限公司);S-P超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)125I放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所);脂多糖(LPS),USA.Sigma公司;RPMIMedum1640培養(yǎng)基(批號(hào):1080385USA.Gibco);五靈膠囊(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科提供,批號(hào):20040122),稱取五靈膠囊2g,蒸餾水加熱溶解至10mL,設(shè)置3個(gè)濃度(2.0,1.0,0.5g·kg-1)供試驗(yàn)。1.2不同給藥劑量對(duì)小鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響昆明小鼠40只,體重(25±2)g,♂,在溫度(22±3)℃、濕度60%～70%的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3d后進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠隨機(jī)分成5組,正常組、LPS組、五靈膠囊2.0,1.0,0.5g·kg-13組,正常組和LPS組分別ig蒸餾水10mL·kg-1,五靈膠囊3個(gè)劑量組分別ig相應(yīng)劑量,各組小鼠每天ig給藥一次,連續(xù)給藥4d,第4天給藥2次,2h后正常組尾靜脈注射生理鹽水2mL·kg-1,其余各組小鼠按體重尾靜脈注射LPS3.5mg·kg-1,小鼠禁食自由飲水,12h后小鼠眼眶取血并分離血清,測(cè)定ALT,AST,ALP;迅速取肝臟,固定,石蠟包埋、切片常規(guī)脫水,參照說明書的操作步驟進(jìn)行免疫組化學(xué)染色:SP法染色一抗稀釋比CD14、TNF-α(1∶100),陰性對(duì)照片采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗,DAB系統(tǒng)顯色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。結(jié)果評(píng)定:標(biāo)本無明確陽性反應(yīng)者為陰性,在40倍鏡下以Miaspro圖象分析系統(tǒng)(四川大學(xué)計(jì)算機(jī)圖象圖形研究所)程序掃描染色陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞面積,每只小鼠肝組織掃描5個(gè)視野,每組共掃描25個(gè)視野,結(jié)果以陽性細(xì)胞率表示。1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組按高春芳等介紹方法,取傳2-3代純化KC用200mL·L-1小牛血清1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度1～108/mL加細(xì)胞懸液1mL于含有8×8mm蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),置37℃,50mL·L-1CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)使細(xì)胞長(zhǎng)至單層。分組:正常組、模型組、五靈膠囊組(0.1mg·mL-1),(n=5)。正常組、模型組加完全培養(yǎng)液1mL,五靈膠囊加含有0.1mg·mL-1五靈膠囊完全培養(yǎng)液1mL,繼續(xù)培養(yǎng)24h,棄除上清;正常組加完全培養(yǎng)液,模型組、五靈膠囊組加含60μg·L-1LPS的培養(yǎng)液1mL,繼續(xù)培養(yǎng)10h,收集上清,-80℃凍存;各孔細(xì)胞爬片用0.01mol·L-1pH7.4的PBS緩沖液洗滌2次,置4℃丙酮固定10min,同上法進(jìn)行免疫組化染色。1.4灌胃靜脈給藥、小鼠血清學(xué)Balb/C小鼠40只,體重(20±2)g,雄性,同上述相同條件飼養(yǎng)3d,隨機(jī)分4組,正常組、LPS組、五靈膠囊1.0和0.5g·kg-1組,每組10只。正常組、LPS組灌胃給予蒸餾水10mL·kg-1,五靈膠囊2組分別ig給藥相應(yīng)劑量,連續(xù)給藥5d,末次給藥2h后,正常組尾靜脈注射生理鹽水2mL·kg-1,余下3個(gè)組小鼠均尾靜脈注射LPS3.5mg·kg-1,小鼠禁食自由飲水,12h后眼眶取血并分離血清,備用。同時(shí)立即取肝臟制備10%肝勻漿,10000r·min-1離心15min,取上清,125I放免法測(cè)定血清與肝勻漿IL-6,IL-8,TNF-α含量。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,所測(cè)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,表2,3數(shù)據(jù)采用Kruskal-Walls秩和檢驗(yàn),余者采用AVOVA行單因素方差分析,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2結(jié)果2.1活性下降p>0.1血清酶活性與正常組比較:模型組ALT,AST活性升高,ALP活性下降(P<0.01);與模型組比較,五靈膠囊2.0,1.0g·kg-1組有降低AST活性作用(P<0.05〉,五靈膠囊2.0g·kg-1組可降低ALT活性(P<0.05),見表1。2.2肝組織tnf-,cd14表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示:正常組肝小葉內(nèi)少量肝細(xì)胞及枯否細(xì)胞呈CD14陽性染色,定位于胞漿;TNF-α陽性染色彌散分布于整個(gè)小葉,定位于胞漿;iNOS陽性表達(dá)與TNF-α相似,定位胞漿或核膜;小葉內(nèi)eNOS陽性染色細(xì)胞散在分布,定位胞漿。模型組肝組織TNF-α,CD14和iNOS表達(dá)陽性率均高于正常組(P<0.01)。五靈膠囊3個(gè)劑量組TNF-α,CD14陽性表達(dá)率在肝組織損傷區(qū)低于模型組(P<0.05)。3個(gè)劑量組iNOS陽性率高于模型組(P<0.01)。見表2。2.3免疫組化陽性染色結(jié)果TNF-α,CD14,iNOS,eNOS定位于KC胞漿,各試驗(yàn)組免疫組化陽性染色結(jié)果以:弱陽性計(jì)1分、陽性計(jì)2分、強(qiáng)陽性計(jì)3分。見表3。2.4兩組血清中il-6,il-8,tnf-含量比較模型組血清與肝勻漿中IL-6,IL-8,TNF-α高于正常組(P<0.01),正常、五靈膠囊兩組血清與肝勻漿中IL-6,IL-8,TNF-α含量均低于模型組(P<0.01),見表4,表5。2.5不同劑量五靈膠囊對(duì)肝說血清素-期肝清胞的影響鏡檢:正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)皮細(xì)胞及枯否細(xì)胞未見增生,可見少量淋巴細(xì)胞。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,匯管區(qū)可見大片肝細(xì)胞嗜酸性變,內(nèi)皮細(xì)胞及枯否細(xì)胞增生肥大,可見大量炎細(xì)胞浸潤。與模型組比較,五靈膠囊2g·kg-1組肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常,內(nèi)皮細(xì)胞及枯否細(xì)胞增生肥大,可見炎細(xì)胞浸潤、聚集;五靈膠囊1g·kg-1組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,中央靜脈周圍肝細(xì)胞空泡樣變、濁腫,匯管區(qū)擴(kuò)張,內(nèi)皮細(xì)胞及枯否細(xì)胞增生肥大,可見炎細(xì)胞浸潤;五靈膠囊0.5g·kg-1組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊,匯管區(qū)擴(kuò)張,中央靜脈周圍肝細(xì)胞濁腫,嗜酸性變,肝細(xì)胞再生增多,內(nèi)皮細(xì)胞及枯否細(xì)胞無明顯增生,伴炎細(xì)胞浸潤。3對(duì)lps誘導(dǎo)肝損傷作用LPS誘導(dǎo)肝損傷是通過激活KC大量釋放TNFα,IL-6,IL-8等促炎細(xì)胞因子所致。結(jié)果顯示小鼠注射LPS后,血清ALT,AST酶活性顯著升高,而ALP水平顯著降低,ALT,AST酶活性顯著升高與血清及肝勻漿中TNFα,IL-6,IL-8含量上升相平行。LPS和TNFα刺激肝細(xì)胞分泌趨化細(xì)胞因子IL-8,IL-8水平上升與肝組織損傷的程度成正比,免疫組化顯示肝組織內(nèi)TNFα,iNOS,eNOS陽性率明顯上升,病理組織學(xué)觀察:模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、大量炎細(xì)胞浸潤、內(nèi)皮細(xì)胞及KC增生肥大、匯管區(qū)擴(kuò)張,組織病理學(xué)結(jié)果與免疫組化學(xué)顯示肝組織內(nèi)TNFα,iNOS和iNOS陽性率上升一致,與文獻(xiàn)慢性肝炎患者血清與組織中TNF-α,IL-6,IL-8水平上升并與肝損傷程度呈正相關(guān)的結(jié)果相同,提示LPS誘導(dǎo)肝損傷是通過激活KC大量釋放TNF-α,IL-6,IL-8等促炎因子所致。五靈膠囊降低LPS導(dǎo)致肝損傷組織ALT,AST酶活性,可使小鼠血清和肝勻漿中TNF-α,IL-6,IL-8水平下降,組織學(xué)觀察肝組織損傷程度也低于模型組,提示五靈膠囊抑制各種誘因誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子是治療肝損傷機(jī)制之一。CD14為L(zhǎng)PS在KC胞膜上效應(yīng)性受體,眾多研究表明,LPS介導(dǎo)KC激活釋放細(xì)胞因子有CD14依賴性和非依賴性途經(jīng),LPS在脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)存在條件下與KCCD14結(jié)合,形成復(fù)合物,體內(nèi)、外試驗(yàn)表明LPS上調(diào)KC表面CD14表達(dá)量則肝損傷明顯地加重。五靈膠囊能降低CD14表達(dá),抑制LPS誘導(dǎo)KC釋放炎癥因子,有效干預(yù)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),這是該藥抑制LPS所致肝損傷的作用機(jī)制,組織學(xué)結(jié)果也為這結(jié)論提供了支持。近年研究表明LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞和KC釋放NO,NO在各種原因所致的肝損傷中參與肝細(xì)胞損傷過程。LPS誘導(dǎo)iNOS生成量增加,活性增強(qiáng),引起肝細(xì)胞損傷。試驗(yàn)顯示五靈膠囊激活iNOS表達(dá),2和1g·kg-1劑量組iNOS表達(dá)量均高于模型組,eNOS表達(dá)量與模型組相似,與我們?cè)缙谠囼?yàn)結(jié)果相似,五靈膠囊激活肝細(xì)胞生成iNOS作用,自然就降低該藥對(duì)抗L