新編生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

PAGE新編生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義謝寧昌劉洋王桂蘭班級(jí)學(xué)號(hào)姓名目錄頁(yè)碼生化實(shí)驗(yàn)安排2實(shí)驗(yàn)一.粗脂肪的定量測(cè)定索氏（SOXhlet）提取法3實(shí)驗(yàn)二.氨基酸的分離鑒定紙層析法5實(shí)驗(yàn)三.血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳7實(shí)驗(yàn)四.蛋白質(zhì)的定量測(cè)定微量克氏（Kjeldahl）定氮法8實(shí)驗(yàn)五.紫外吸收法測(cè)定核酸的含量12實(shí)驗(yàn)六.酶活力測(cè)定14實(shí)驗(yàn)七.血糖的定量測(cè)定Hagedorn-Juensen定糖法17實(shí)驗(yàn)八.米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)的測(cè)定19實(shí)驗(yàn)九.酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作和初速度的測(cè)定23 生化實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放規(guī)則實(shí)驗(yàn)計(jì)劃專(zhuān)業(yè)學(xué)時(shí)數(shù)人數(shù)應(yīng)做實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)大樓404實(shí)驗(yàn)室生物工程401901-9制藥工程201361、3、5、6、7藥物制劑301061、2、3、5、6、7、8實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和管理實(shí)驗(yàn)員序號(hào)123456789實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)粗脂肪的定量測(cè)定-索氏提取法氨基酸的分離鑒定-紙層析法血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳蛋白質(zhì)的定量測(cè)定-微量克氏定氮法紫外吸收法測(cè)定核酸的含量酶的活力測(cè)定血糖的定量測(cè)定米氏方程的確定酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作和初速度的測(cè)定耗時(shí)（hr）464644444專(zhuān)業(yè)生工藥劑制藥生工藥劑生工藥劑制藥生工生工藥劑制藥生工藥劑制藥生工藥劑制藥生工藥劑生工操作臺(tái)（個(gè)）848488844管理實(shí)驗(yàn)員王浩琦/王習(xí)霞王桂蘭/唐開(kāi)華王桂蘭/唐開(kāi)華王浩琦/王習(xí)霞劉洋/曹慧君劉洋/曹慧君王浩琦/王習(xí)霞劉洋/曹慧君劉洋/曹慧君生化實(shí)驗(yàn)室的開(kāi)放時(shí)間表時(shí)間節(jié)星期一星期二星期三星期四星期五上午1-24-16周開(kāi)放6hr/日8:45±10分鐘必須到實(shí)驗(yàn)室報(bào)到3-44-16周開(kāi)放6hr/日10:15±10分鐘必須到實(shí)驗(yàn)室報(bào)到中午午休下午5-64-16周開(kāi)放6hr/日13:30±10分鐘必須到實(shí)驗(yàn)室報(bào)到4-16周開(kāi)放6hr/日13:30±10分鐘必須到實(shí)驗(yàn)室報(bào)到7-84-16周開(kāi)放6hr/日13:30～15:30必須到實(shí)驗(yàn)室報(bào)到4-16周開(kāi)放6hr/日14:15±10分鐘必須到實(shí)驗(yàn)室報(bào)到4-16周開(kāi)放6hr/日13:30～15:30必須到實(shí)驗(yàn)室報(bào)到晚飯晚上9-1011-12加班人員單周唐開(kāi)華/夏榮慧/顧永明王浩綺/張玲/賀忠王桂蘭/張玲/周治曹慧君/夏榮慧/梅艷珍劉洋/張玲/王衛(wèi)國(guó)雙周王桂蘭/夏榮慧/周治王浩綺/張玲/賀忠唐開(kāi)華/張玲/顧永明劉洋/夏榮慧/王衛(wèi)國(guó)曹慧君/張玲/梅艷珍規(guī)則1.同學(xué)們應(yīng)至少提前2天到實(shí)驗(yàn)室預(yù)定或修改要做的實(shí)驗(yàn)，以便實(shí)驗(yàn)員做好準(zhǔn)備，請(qǐng)大家務(wù)必不要按照講課的順序選實(shí)驗(yàn)，只要根據(jù)講義和實(shí)驗(yàn)軟件預(yù)習(xí)好了，就可來(lái)選做。實(shí)驗(yàn)大樓429實(shí)驗(yàn)室是多媒體實(shí)驗(yàn)室，為同學(xué)們準(zhǔn)備好了生化實(shí)驗(yàn)講義和生化實(shí)驗(yàn)軟件，全天開(kāi)放，歡迎大家前來(lái)預(yù)習(xí)。希望同學(xué)們盡量靠前安排做實(shí)驗(yàn)，不要拖到學(xué)期末。2.一旦預(yù)定好了實(shí)驗(yàn)，就得守時(shí)，不許缺席，不許遲到，以免造成試劑浪費(fèi)和影響下一輪同學(xué)做實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)同學(xué)們務(wù)必在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)到實(shí)驗(yàn)室找管理實(shí)驗(yàn)員報(bào)到。報(bào)到時(shí)請(qǐng)出示預(yù)習(xí)報(bào)告，以便做完實(shí)驗(yàn)填上數(shù)據(jù)后立即交上。3.實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)注意看一下黑板的提示以及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的有關(guān)標(biāo)語(yǔ)。4.實(shí)驗(yàn)1、3、5、6、7可各自同時(shí)開(kāi)放8個(gè)操作臺(tái)，實(shí)驗(yàn)2、4、8、9可各自同時(shí)開(kāi)放4個(gè)操作臺(tái)，每個(gè)操作臺(tái)可容1組人做實(shí)驗(yàn)，每組1人。實(shí)驗(yàn)一.粗脂肪的定量測(cè)定——索氏（SOXhlet）提取法目的和要求學(xué)習(xí)和掌握脂肪提取的原理和測(cè)定方法。熟悉和掌握重量分析的基本操作。原理本法為重量法。用脂肪溶劑將脂肪提取后進(jìn)行稱(chēng)量。該法適用于固體和液體樣品。通常將樣品浸于脂肪溶劑，如乙醚或沸點(diǎn)為30℃至60℃的石油醚，借助于索氏提取器進(jìn)行循環(huán)抽提。用本法提取的脂溶性物質(zhì)為脂肪類(lèi)物質(zhì)的混合物，其中含有脂肪、游離脂肪酸、磷脂、糖脂、固醇、芳香油、某些色素及有機(jī)酸等，稱(chēng)為粗脂肪。用該法測(cè)定樣品含油量時(shí)，通常采用沸點(diǎn)低于50℃的有機(jī)溶劑作為脂肪溶劑。此時(shí)，樣品中結(jié)合狀態(tài)的脂類(lèi)(主要是脂蛋白)不能直接提取出來(lái)。所以該法又稱(chēng)為游離脂類(lèi)定量測(cè)定的方法。樣品的準(zhǔn)備稱(chēng)取樣品的重量根據(jù)材料中脂肪的含量而定（參考表1-1）。通常脂肪含量在10%以下的，稱(chēng)取樣品10-20克。脂肪含量為50-60%的，則稱(chēng)取樣品2-4克。表1-1幾種干的植物種子和種仁中油脂的百分含量樣品含油量%樣品含油量%向日葵種籽向日葵種仁蓖麻種籽蓖麻種仁芝麻種籽油菜種籽花生種仁23.5-45.040.0-67.845.1-58.550.7-72.046.2-61.041.1-42.940.2-60.7大豆種籽油桐種仁玉米谷粒小麥谷粒稻子谷粒豌豆種籽10.0-25.047.8-68.93.0-9.01.6-2.61.3-2.40.7-1.9將樣品在80℃-100℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘去水分，一般烘4小時(shí)，烘干時(shí)要避免過(guò)熱。樣品顆粒不宜太大，一般要在研缽中研碎樣品。樣品若是液體，應(yīng)將一定體積的樣品滴在濾紙上，在60℃-80℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干后，在裝入提取管中提取。實(shí)驗(yàn)試劑<1>.樣品:2g/組。<2>.石油醚：ＣＰ，沸程３０～６０℃，６０ml/組實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材<1>.BS2105型電子天平：公用操作指南：插上電源，啟動(dòng)“ON/OFF”開(kāi)關(guān)，按一下回零檔“TARE”，使屏幕上顯示0.0000，推開(kāi)玻璃門(mén)，輕輕將樣品置于稱(chēng)量盤(pán)上，關(guān)上玻璃門(mén)，待屏幕上顯示的數(shù)字穩(wěn)定后記錄下來(lái)，即為樣品的重量（g）。注意：每次稱(chēng)量前都必須按一下回零檔“TARE”，使屏幕上顯示0.0000；稱(chēng)量室內(nèi)尤其是稱(chēng)量盤(pán)上必須保持清潔、干燥，若有藥品撒落，立即用軟毛刷清理干凈。<2>.HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：1臺(tái)/2組操作指南：向水浴鍋中注滿(mǎn)自來(lái)水，蓋好蓋子，插上電源。先將“設(shè)定/測(cè)溫”選擇開(kāi)關(guān)置于“設(shè)定”檔，調(diào)節(jié)“溫度設(shè)定”旋鈕使屏幕上的溫度顯示為所需的溫度（本實(shí)驗(yàn)為85℃左右），此時(shí)黃燈亮，表示儀器正在加熱。然后將“設(shè)定/測(cè)溫”選擇開(kāi)關(guān)置于“測(cè)溫”檔，此時(shí)屏幕上的溫度顯示為實(shí)際水溫，當(dāng)實(shí)際水溫達(dá)到設(shè)定的溫度時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)恒溫，此時(shí)綠燈亮。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)該將恒溫水浴鍋的水溫調(diào)節(jié)好。<3>.電熱鼓風(fēng)干燥箱：公用<4>.索氏提取儀（50ml）（如下圖所示）：1套/組由冷凝管、抽提管和平底燒瓶三個(gè)部件組成，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)磨口相對(duì)接搭建裝置（見(jiàn)示范樣本）：用鐵架臺(tái)、２只十字夾、２只龍爪、２根乳膠管和１套索氏提取儀來(lái)搭建裝置，固定點(diǎn)分別是平底燒瓶的頸部和提取管的頸部，索氏提取儀的高度以平底燒瓶的瓶頸略高于恒溫水浴鍋的液面為宜。注意：用龍爪夾玻璃儀器時(shí)，要先用手找好感覺(jué)，不能太緊（那樣會(huì)夾破）也不能太松（那樣會(huì)打滑，致使索氏提取儀的標(biāo)準(zhǔn)磨口接口漏氣）<5>.其他器材：不銹鋼鑷子、藥勺、濾紙、鐵架臺(tái)1件/組、十字夾、龍爪、手套、乳膠管2件/組學(xué)生操作準(zhǔn)備工作：將恒溫水浴鍋的水溫事先加熱好，將干燥潔凈的平底燒瓶（索氏提取儀部件之一）在電子天平上稱(chēng)重。<1>.折濾紙斗：戴上手套，取一張濾紙（φ11cm）,卷成筒狀，再將其一端折起來(lái)封死，便做成了濾紙斗（見(jiàn)示范樣本）。<2>.稱(chēng)樣：先將濾紙斗在電子天平上稱(chēng)重，然后用藥勺?。采讟悠罚s2克左右）裝入濾紙斗中，把濾紙斗的開(kāi)口處折起來(lái)封死，調(diào)整濾紙斗的高度，使其放在抽提管中時(shí)略低于虹吸管的上彎頭處。將裝好樣品的濾紙斗放在電子天平上稱(chēng)重，兩重量之差即為樣品的重量。<3>.提?。簩⑺魇咸崛x按照示范樣本的方式安裝好（參見(jiàn)樣品，注意燒瓶的高度），把裝有樣品的濾紙斗放入提取管內(nèi)，向平底燒瓶中注入約50ml的石油醚，檢查一下，確保所有接口均對(duì)接完好（不漏氣，不打滑），打開(kāi)自來(lái)水（冷凝用），將索氏提取儀放入恒溫水浴鍋中加熱（水溫85℃左右）。提取時(shí)間大約2個(gè)小時(shí)，記錄提取的頻率（虹吸一次的時(shí)間）和總提取時(shí)間，計(jì)算提取的次數(shù)。附注：一般樣品的提取時(shí)間應(yīng)該為12～24小時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間的限制，我們的提取率只能達(dá)到80％左右。<4>.回收石油醚：提取2小時(shí)后，當(dāng)石油醚在提取管中的液面即將達(dá)到虹吸管的上彎頭處時(shí)，從水浴鍋中取出索氏提取儀，室溫冷卻5～10分鐘，取下平底燒瓶，將提取管的下端口插入回收瓶中，傾斜裝置，提取管中的石油醚會(huì)流入回收瓶中，達(dá)到回收的目的。再裝上平底燒瓶，繼續(xù)放入恒溫水浴鍋中加熱直至冷凝管下端無(wú)石油醚滴下，表明平底燒瓶中的石油醚已經(jīng)蒸干。取下平底燒瓶，回收提取管中的石油醚。將平底燒瓶放入120℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘15分鐘，取出冷卻后稱(chēng)重（注意戴手套，以免燙壞手），它與空瓶的重量之差就是粗脂的重量。<5>.從提取管中取出濾紙斗，將平底燒瓶用洗滌劑清洗干凈，置于干燥箱中烘干，其它玻璃儀器放在桌面上，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。計(jì)算樣品粗脂的含量（%）=（粗脂的重量/樣品的重量）*100%記錄與計(jì)算匯總：濾紙斗重濾紙斗+樣品重?zé)恐責(zé)?粗脂重樣品重粗脂重樣品中粗脂的含量實(shí)驗(yàn)二.氨基酸的分離鑒定—紙層析法目的通過(guò)氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶液由有機(jī)溶劑和水組成。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移）來(lái)表示的:Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。器材(1).層析缸或大燒杯（5000ml）:1只/組(2).微量進(jìn)樣器（100ul）：1只/組(3).噴霧器:公用(4).培養(yǎng)皿：1只/組(5).層析濾紙（長(zhǎng)22厘米、寬14厘米的新華一號(hào)濾紙）:1張/組(6).直尺、針、白線、鉛筆、手套：自備(7).電吹風(fēng)：1只/組試劑(1).擴(kuò)展劑：為4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將4體積正丁醇和1體積冰醋酸放入分液漏斗中，與體積水混合，充分振蕩，靜置后分層，棄去下層水層。(2).氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3種（賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸），0.5%的未知氨基酸液1種。(3).顯色劑:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。學(xué)生操作(1).剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約20ml展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料薄膜密封起來(lái)（參見(jiàn)樣品），平衡20分鐘。(2).帶上手套，取寬約14厘米、高約22厘米的層析濾紙一張。在紙的一端距邊緣2-3厘米處輕輕用鉛筆劃一條直線，在直線上每間隔2厘米作一記號(hào)，一共做4個(gè)記號(hào)，這就是原點(diǎn)的位置，見(jiàn)左下圖。(3).點(diǎn)樣：用微量注射器分別取5ul的氨基酸樣品（每取一個(gè)樣之前都要用蒸餾水洗一下微量注射器），點(diǎn)在這四個(gè)位置上。擠一滴點(diǎn)一次，同一位置上需點(diǎn)2-3次，2-3ul/次，每點(diǎn)完一點(diǎn)，立刻用電吹風(fēng)熱風(fēng)(注意：電吹風(fēng)不可壓在其電源線上，以免烤焦)吹干后再點(diǎn)，以保證每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過(guò)3毫米。每人須點(diǎn)4個(gè)樣，其中3個(gè)是已知的，1個(gè)是未知樣品。(4).層析：用針、線將濾紙縫成筒狀（見(jiàn)右上圖），紙的兩側(cè)邊緣不能接觸。向培養(yǎng)皿中加入約80毫升擴(kuò)展劑，并迅速置于倒置的層析缸或大燒杯中，將點(diǎn)號(hào)樣的濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線約1厘米，見(jiàn)右上圖），仍用塑料薄膜密封（參見(jiàn)樣品）。層析2小時(shí)左右后，溶劑上升約10厘米，取出濾紙，立即用鉛筆描出溶劑前沿線，迅速用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干。(5).顯色：用噴霧器在通風(fēng)廚中向?yàn)V紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用熱風(fēng)吹干，即可顯出各層析斑點(diǎn)。(6).計(jì)算各種氨基酸的Rf值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸。將濾紙裁開(kāi)，各人將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上。(7).將微量注射器內(nèi)外用蒸餾水清洗干凈，倒掉用過(guò)的展層液和平衡液，將培養(yǎng)皿洗凈，用衛(wèi)生紙擦干，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。計(jì)算：Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離記錄與計(jì)算匯總：賴(lài)氨酸苯丙氨酸纈氨酸未知氨基酸原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離Rf判斷未知氨基酸實(shí)驗(yàn)三.血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳目的學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理。原理醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法,醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，它具有均一的泡沫樣的結(jié)構(gòu)，厚度僅120微米，有強(qiáng)滲透性，對(duì)分子移動(dòng)無(wú)阻力，作為區(qū)帶電泳的支持物進(jìn)行蛋白電泳有簡(jiǎn)便、快速、樣品用量少，應(yīng)用范圍廣，分離清晰，沒(méi)有吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白，糖蛋白和、同功酶的分離及用在免疫電泳中。器材1.醋酸纖維薄膜（2*8厘米）:1片/人，即2片/組。2.常壓電泳儀：1套/2組操作指南：電泳儀由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成，兩者之間有專(zhuān)門(mén)的連線連接。電泳槽有兩個(gè)互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個(gè)槽上都有一根可移動(dòng)的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋，兩桿之間的距離調(diào)節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長(zhǎng)度，點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜就是搭在濾紙橋上，詳見(jiàn)下面的“醋酸纖維素薄膜電泳裝置示意圖”。穩(wěn)壓電源用于調(diào)節(jié)電壓和通電時(shí)間，當(dāng)電泳槽和穩(wěn)壓電源連接好后，將點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜搭在濾紙橋上，蓋上蓋子，調(diào)整好電壓，就可以通電電泳了。注意電泳槽的電極方向，負(fù)極應(yīng)與醋酸纖維薄膜上的點(diǎn)樣原點(diǎn)在同一側(cè)。3.培養(yǎng)皿：一排桌子（即4組）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.點(diǎn)樣器：一個(gè)/組5.粗濾紙6.玻璃板：一塊/組7.鑷子：一個(gè)/組8.玻棒：公用試劑1．巴比妥緩沖液（PH8.6，離子強(qiáng)度0.07）巴比妥2.76克，巴比妥鈉15.45克，加水至1000毫升。2．染色液含氨基黑10B0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升（可重復(fù)使用）。3．漂洗液含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。4．透明液含無(wú)水乙醇7份，冰醋酸3份。操作1.浸泡：用鑷子取醋酸纖維薄膜2張，識(shí)別出光澤面與粗糙面，將粗面朝上放在緩沖液中浸泡20分鐘。2.點(diǎn)樣：事先用點(diǎn)樣器在濾紙上點(diǎn)幾個(gè)樣，熟悉一下點(diǎn)樣器的用法。然后把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層濾紙內(nèi)吸干表面多余的液體，粗糙面朝上平鋪在玻璃板上，用玻棒蘸一點(diǎn)血清，再將點(diǎn)樣器沾一下玻棒，則血清就會(huì)均勻地分布在了點(diǎn)樣器的狹縫中，將點(diǎn)樣器在膜條一端2～3cm處輕輕地垂直落下并隨即提起，這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品，見(jiàn)下圖。每人點(diǎn)一個(gè)樣。3．電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個(gè)電極槽內(nèi)的液面等高，做好濾紙橋（濾紙橋的制作如下：先剪裁尺寸合適的濾紙，對(duì)折一下，一頭涼在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，調(diào)節(jié)橫桿之間的距離到略小于醋酸纖維薄膜的長(zhǎng)度即可，這一步由老師準(zhǔn)備好）。用鑷子將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。膜條上點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極。當(dāng)4片醋酸纖維薄膜都放好后，蓋嚴(yán)電泳室，檢查一下電泳槽和穩(wěn)壓電源是否已經(jīng)連接好，通電。調(diào)節(jié)電壓至160V，此時(shí)的電流強(qiáng)度為0.4～0.7毫安/厘米膜寬，電泳時(shí)間約為40分鐘。以下4.、5.兩步的操作，請(qǐng)相鄰四個(gè)組的同學(xué)們集中一起做。4．染色：電泳完畢后，關(guān)上電源開(kāi)關(guān)，用鑷子將薄膜條取下并放在裝有染色液的培養(yǎng)皿中浸泡10分鐘（注意蓋好培養(yǎng)皿的蓋子）5．漂洗：將膜條從染色液中取出，在培養(yǎng)皿的邊緣上瀝去表面多余的染色液，依次放入裝有漂洗液的培養(yǎng)皿(共有3套)中漂洗3次（未漂洗時(shí)注意蓋好培養(yǎng)皿的蓋子），至無(wú)蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得色帶清晰的電泳圖譜。試驗(yàn)至此結(jié)束，將染色液、緩沖液回收，漂洗液和平衡液倒掉，培養(yǎng)皿清洗干凈，用衛(wèi)生紙擦干水分，倒置于桌面上，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。下次交實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)請(qǐng)將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上。如果需要定量測(cè)定，可以將膜條用濾紙壓平吸干，按區(qū)帶分段剪開(kāi)，分別浸在體積0.4當(dāng)量/升氫氧化鈉溶液中，并剪取相同大小的無(wú)色帶膜條作空白對(duì)照，進(jìn)行比色?；蛘邔⒏稍锏碾娪緢D譜膜條放入透明液中浸泡2～3分鐘后取出貼于潔凈玻璃板上，干后即為透明的薄膜圖譜，可用光密度計(jì)直接測(cè)定。實(shí)驗(yàn)四.微量克氏（Kjeldahl）定氮法目的學(xué)習(xí)微量克氏定氮法的原理和操作技術(shù)。原理樣品與濃硫酸共熱時(shí)，分解出氮、二氧化碳和水，氮轉(zhuǎn)變出的氨，進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過(guò)程通常稱(chēng)之為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行的比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。若以甘氨酸為例，其消化過(guò)程可表示如下：CH3NH2COOH+3H2SO4→3CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反應(yīng)（1）、（2）在克氏燒瓶中完成。反應(yīng)（3）在克氏蒸餾裝置內(nèi)進(jìn)行。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨。借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到定量、定濃度的硼酸溶液中，氨與溶液中的氫離子結(jié)合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定至恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度為止。最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)的克當(dāng)量數(shù)計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。試劑(1)1%卵清蛋白溶液：1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液，并稀釋至100ml，如有不溶物，離心取上清液備用。(2)濃硫酸（AR）(3)硫酸鉀3份與硫酸銅1份（W/W）混合研磨成粉末。(4)30%氫氧化鈉溶液：30g氫氧化鈉溶于蒸餾水，稀釋至100ml。(5)2%硼酸溶液：2g硼酸溶于蒸餾水，稀釋至100ml。(6)混合指示劑：0.1%甲基紅酒精溶液和0.1%甲稀藍(lán)酒精溶液按4：1比例（V/V）混合。(7)0.01N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液：用恒沸鹽酸準(zhǔn)確稀釋。實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材微量克氏定氮儀(見(jiàn)下圖所示)：1套/組克氏定氮燒瓶：1只/組電爐：公用微量滴定管（5ml）：1只/2組酒精燈：1只/組錐形瓶(100ml)：4只/組鐵架臺(tái)、十字夾、龍爪、打火機(jī)、表面皿、吸管、量筒、小玻璃珠等。樣品處理某一固體樣品中的含氮量是用100克該物質(zhì)（干重）中所含氮的克數(shù)來(lái)表示（%）。因此在定氮前應(yīng)先將固體樣品中的水分除掉。一般樣品烘干的溫度都采用105℃以下烘干。在稱(chēng)量瓶中稱(chēng)入一定量磨細(xì)的樣品，然后置于105℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥4小時(shí)。用坩堝鉗將稱(chēng)量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱(chēng)重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1小時(shí)后，稱(chēng)重一次，直到兩次稱(chēng)量數(shù)值不變，即達(dá)恒重。若樣品為液體（如血清等），可取一定體積樣品直接消化測(cè)定。學(xué)生操作12--改良式微量克氏定氮儀（蒸餾瓶）1反應(yīng)室2．蒸汽發(fā)生室3．加樣口的小漏斗12--改良式微量克氏定氮儀（蒸餾瓶）1反應(yīng)室2．蒸汽發(fā)生室3．加樣口的小漏斗4．冷凝器5．自來(lái)水進(jìn)口6．冷凝水出口7．蒸汽發(fā)生室加水口8．廢液排出口9．錐形瓶10．出樣口11．酒精燈12．導(dǎo)管(二)蒸餾：取100ml錐形瓶3只，洗滌干凈，用進(jìn)樣器各加入2%硼酸溶液5.0ml,蓋好備用。如錐形瓶?jī)?nèi)液體呈綠色，需重新洗滌。安裝好微量克氏定氮儀，微量克氏定氮儀實(shí)際上是一套蒸餾裝置（如圖所示），裝置的搭建見(jiàn)示范樣本。1.蒸餾瓶的洗滌：將自來(lái)水由（5）經(jīng)(7)注入到蒸餾瓶夾層（即蒸汽發(fā)生器）(2)中，使水面稍低于蒸餾瓶頸部的轉(zhuǎn)彎處。把裝有蒸餾水的錐形瓶（9）置于冷凝器(4)下方，并將冷凝器下方的導(dǎo)管（12）下端插入錐形瓶液面以下，再將少量蒸餾水由漏斗(3)注入到蒸餾瓶的反應(yīng)室（1）中，把所有夾子夾緊。打開(kāi)冷凝水，用酒精燈（11）將蒸餾瓶夾層(2)內(nèi)的水煮沸，然后移去火源，錐形瓶（9）中的蒸餾水就會(huì)從冷凝器下方的導(dǎo)管（12）倒流到蒸餾瓶的反應(yīng)室（1）內(nèi)，再倒流至蒸餾瓶的夾層(2)中，可以由廢液排出口(8)排出。按照上述方法將儀器洗滌2～3次。最后，反應(yīng)室（1）中的余液可以按下法清空：把所有夾子夾緊，將蒸餾瓶夾層(2)內(nèi)的水煮沸，先移去錐形瓶（9）,然后移去火源，反應(yīng)室（1）中余液將倒流至夾層(2)中，由（8）排出。以后每次在做下一次蒸餾之前都要先將蒸餾瓶洗滌2～3次，并將反應(yīng)室（1）清空。2.樣品的蒸餾：把裝有5.0ml的2%硼酸溶液的錐形瓶(9)置于冷凝器的下方，將冷凝器下方的導(dǎo)管（12）下端插入液面以下，錐形瓶?jī)?nèi)須事先加入指示劑（注意此時(shí)的顏色，它將是后面滴定終點(diǎn)的顏色）。先將克氏燒瓶中消化好了的消化液由小漏斗(3)注入到蒸餾瓶的反應(yīng)室（1）中，用蒸餾水洗滌克氏燒瓶二次（每次約2ml），洗滌液皆由漏斗(3)注入反應(yīng)室（1），用小量筒取30%氫氧化鈉溶液15ml，傾入小漏斗，放松夾子，讓緩緩流入反應(yīng)室（1），當(dāng)小漏斗內(nèi)仍有少量NaOH溶液時(shí)，立即夾緊夾子（以上操作當(dāng)心勿將NaOH溶液濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上）。再加約3ml蒸餾水于小漏斗內(nèi)，同樣緩緩放入反應(yīng)室，并留少量水在漏斗內(nèi)作水封。把所有夾子夾緊,打開(kāi)冷凝水，開(kāi)始用酒精燈加熱，將蒸餾瓶夾層(2)內(nèi)的水煮沸。從蒸餾瓶?jī)?nèi)的水溶液沸騰開(kāi)始計(jì)算時(shí)間，大約10分鐘即可蒸餾完畢。將導(dǎo)管（12）的下端抽出液面，繼續(xù)蒸餾1分鐘，使導(dǎo)管內(nèi)的余液落回錐形瓶(9)中，移開(kāi)錐形瓶，用表面皿蓋好等待滴定。移去火源，反應(yīng)室（1）中的殘液將會(huì)倒流至夾層(2)中，由（8）排出。注意，在樣品蒸餾的整個(gè)過(guò)程中，嚴(yán)禁中途移去火源，以防倒吸。在做下一次蒸餾之前先將蒸餾瓶洗滌2～3次，并將反應(yīng)室（1）清空。（三）.滴定：用0.01NHCl溶液滴定錐形瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色（也就是前面加了指示劑后的標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的顏色）。記錄所耗HCl溶液毫升數(shù).（四）.徹底清洗所使用過(guò)的所有玻璃儀器，倒置在桌面上，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。（五）.計(jì)算:樣品含氮量（％）＝（A-B）/1000*N*14/C*100％＝0.014*（A-B）*100％A=滴定樣品用去的HCl溶液毫升數(shù)；B=滴定空白用去的HCl溶液毫升數(shù)；C=卵清蛋白溶液的濃度，1％；N=鹽酸的當(dāng)量濃度，0.01N；14為氮原子量樣品中蛋白質(zhì)含量（％）=樣品含氮量（％）/16%記錄與計(jì)算匯總A（ml）B（ml）含氮量（％）蛋白質(zhì)含量（％）實(shí)驗(yàn)五.紫外吸收法測(cè)定核酸的含量目的了解紫外分光光度計(jì)的基本原理和使用方法。學(xué)習(xí)使用紫外分光光度法測(cè)定核酸含量的原理和操作方法。原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵系統(tǒng)，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收高峰在260毫微米波長(zhǎng)處。一般在260毫微米波長(zhǎng)下，每毫升含1微克DNA溶液的光吸收值約為0.020，每毫升含1微克RNA溶液的光吸收值為0.022。故測(cè)定未知濃度RNA或DNA溶液260毫微米的光吸收值即可計(jì)算出其中核酸的含量。此法操作簡(jiǎn)便，迅速。若樣品內(nèi)混雜有大量的核苷酸或蛋白質(zhì)等能吸收紫外光的物質(zhì)，則測(cè)定誤差較大，故應(yīng)設(shè)法事先除去。器材UV-9100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)操作指南：插上電源插頭，打開(kāi)儀器右側(cè)面下方的電源開(kāi)關(guān)，將儀器背后面下方的燈光選擇桿撥到“D”處（即氘燈），再按一下儀器右側(cè)面下方的氘燈觸發(fā)按鈕，氘燈即點(diǎn)亮。調(diào)節(jié)“波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕”使波長(zhǎng)顯示窗中的數(shù)字為所需的波長(zhǎng)（本實(shí)驗(yàn)為260納米），推開(kāi)比色室的蓋子。將空白和樣品溶液分別仔細(xì)倒入特殊的石英比色皿中（倒入之前先用少量溶液潤(rùn)洗比色皿一次），用衛(wèi)生紙擦去比色皿表面的余液，然后將比色皿插入比色室里的卡座中，拉動(dòng)卡座拉桿，將空白液的比色皿置于光路中。按一下“MODE”鍵，使“%T”的指示燈亮，在比色室的蓋子打開(kāi)的狀態(tài)下按一下“0%T”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為0.000。關(guān)閉比色室的蓋子，按一下“100%TABSO”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為100.0。這樣，儀器就調(diào)整好了。再按一下“MODE”鍵，使“ABS”指示燈亮，按一下“100%TABSO”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為0.000。拉動(dòng)卡座拉桿，將樣品液的比色皿置于光路中，此時(shí)，顯示窗中的數(shù)字即為樣品的吸光度。按一下“PRINT”鍵，將測(cè)定結(jié)果打印出來(lái)。測(cè)定完后，將比色皿中的溶液倒入廢液缸（自帶）中，用蒸餾水（洗瓶）潤(rùn)洗3次，裝入盒中。注意保持分光光度計(jì)的比色室內(nèi)始終干燥干凈，嚴(yán)禁將溶液灑落比色室。不測(cè)定時(shí)，請(qǐng)將比色室的蓋子打開(kāi)。關(guān)于比色皿：比色皿的前后有2個(gè)光滑面，是用來(lái)對(duì)準(zhǔn)光路的，左右有2個(gè)粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接觸光滑面。比色皿的內(nèi)部的清洗只能用蒸餾水潤(rùn)洗（用洗瓶），不可用衛(wèi)生紙或其它物品捅進(jìn)去擦洗，比色皿的2個(gè)光滑面一定要保持清潔，如發(fā)現(xiàn)有指紋或殘液，須用衛(wèi)生紙輕輕擦拭干凈。比色皿是成套發(fā)放的，嚴(yán)禁混用。其他器材：取樣器，試管，試管架、燒杯、擦鏡紙?jiān)噭?biāo)準(zhǔn)RNA溶液：100ug/ml待測(cè)的RNA溶液操作方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取7只試管、2只吸管（分別為1ml和5ml）按照下表加樣：試管1234567標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液(ml)00.10.20.40.60.81蒸餾水（ml）54.94.84.64.44.24A2600混勻后以1號(hào)試管為空白在260nm處測(cè)定光吸收值A(chǔ)，以濃度為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)在坐標(biāo)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，它應(yīng)該是一條直線。樣品測(cè)定：取一支試管，編號(hào)8，加入6ml左右待測(cè)的RNA溶液，仍以1號(hào)試管為空白,分別在260nm和280nm處測(cè)定光吸收值A(chǔ)，用A260在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)的RNA溶液的濃度。并計(jì)算A260/A280，此值大于2表示待測(cè)的RNA樣品很純。將用過(guò)的試管和取樣器洗凈，并注意清潔紫外分光光度計(jì)和自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。記錄與計(jì)算匯總試管2345678A260待測(cè)的RNA溶液的濃度待測(cè)的RNA溶液的A260/A280實(shí)驗(yàn)六.酶的活力測(cè)定一、目的通過(guò)對(duì)酶促反應(yīng)速度的測(cè)定，計(jì)算出酶的活力。二.原理酸性磷酸酯酶(acidphosphatase，E．C．3．1．3．2．)存在于植物的種子、霉菌、肝臟和人體的前列腺之中，能專(zhuān)一水解磷酸單酯鍵。本實(shí)驗(yàn)選用綠豆芽的酸性磷酸酯酶為材料，磷酸苯二鈉為底物。磷酸苯二鈉經(jīng)過(guò)酸性磷酸酯酶作用，水解以后即生成酚和無(wú)機(jī)磷，其反應(yīng)式如下：O‖C6H6―O―P―ONa∣ONa+H2O酶====C6H6－OH+Na2HPO4由上式可見(jiàn)，當(dāng)有足夠量的底物磷酸苯二鈉存在時(shí)，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的產(chǎn)物酚和無(wú)機(jī)磷也越多。根據(jù)酶活力單位的定義，在酶反應(yīng)的最適條件下每分鐘生成1微摩爾(μmole)產(chǎn)物所需要的酶量稱(chēng)為一個(gè)活力單位，因此可用Folin-酚法測(cè)定產(chǎn)物酚或用定磷法測(cè)定無(wú)機(jī)磷來(lái)表示酸性磷酸酯酶的活力。本實(shí)驗(yàn)所采用的是Folin-酚法。三、儀器、材料和試劑1．主要儀器<1>.VIS-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì)操作指南：插上電源插頭，打開(kāi)儀器右側(cè)面下方的電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)“波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕”使波長(zhǎng)顯示窗中的數(shù)字為所需的波長(zhǎng)（本實(shí)驗(yàn)為680納米），推開(kāi)比色室的蓋子。將空白和樣品溶液分別仔細(xì)倒入比色皿中（倒入之前先用少量溶液潤(rùn)洗比色皿一次），用衛(wèi)生紙擦去比色皿表面的余液，然后將比色皿插入比色室里的卡座中，拉動(dòng)卡座拉桿，將空白液的比色皿置于光路中。按一下“MODE”鍵，使“%T”的指示燈亮，在比色室的蓋子打開(kāi)的狀態(tài)下按一下“0%T”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為0.000。關(guān)閉比色室的蓋子，按一下“100%TABSO”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為100.0。這樣，儀器就調(diào)整好了。再按一下“MODE”鍵，使“ABS”指示燈亮，按一下“100%TABSO”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為0.000。拉動(dòng)卡座拉桿，將樣品液的比色皿置于光路中，此時(shí)，顯示窗中的數(shù)字即為樣品的吸光度。按一下“PRINT”鍵，將測(cè)定結(jié)果打印出來(lái)。測(cè)定完后，將比色皿中的溶液倒入廢液缸（自帶）中，用蒸餾水（洗瓶）潤(rùn)洗3次，裝入盒中。注意保持分光光度計(jì)的比色室內(nèi)始終干燥干凈，嚴(yán)禁將溶液灑落比色室。不測(cè)定時(shí)，請(qǐng)將比色室的蓋子打開(kāi)。關(guān)于比色皿：比色皿的前后有2個(gè)光滑面，是用來(lái)對(duì)準(zhǔn)光路的，左右有2個(gè)粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接觸光滑面。比色皿的內(nèi)部的清洗只能用蒸餾水潤(rùn)洗（用洗瓶），不可用衛(wèi)生紙或其它物品捅進(jìn)去擦洗，比色皿的2個(gè)光滑面一定要保持清潔，如發(fā)現(xiàn)有指紋或殘液，須用衛(wèi)生紙輕輕擦拭干凈。比色皿是成套發(fā)放的，嚴(yán)禁混用。<2>.HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋操作指南：向水浴鍋中注滿(mǎn)自來(lái)水，蓋好蓋子，插上電源。先將“設(shè)定/測(cè)溫”選擇開(kāi)關(guān)置于“設(shè)定”檔，調(diào)節(jié)“溫度設(shè)定”旋鈕使屏幕上的溫度顯示為所需的溫度（本實(shí)驗(yàn)為35度），此時(shí)黃燈亮，表示儀器正在加熱。然后將“設(shè)定/測(cè)溫”選擇開(kāi)關(guān)置于“測(cè)溫”檔，此時(shí)屏幕上的溫度顯示為實(shí)際水溫，當(dāng)實(shí)際水溫達(dá)到設(shè)定的溫度時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)恒溫，此時(shí)綠燈亮。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)該將恒溫水浴鍋的水溫調(diào)節(jié)好。<3>.試管架<4>.取樣器2只（1只1ml、1只5ml）<5>.試管10只2．材料酸性磷酸酯原酶液：取一定量的綠豆芽，除去其根、頭部，稱(chēng)取豆芽莖，用研缽研磨，每10克豆芽莖加入2毫升0.2M的pH5.6的乙酸鹽緩沖液，置冰箱過(guò)夜。次日用紗布?jí)赫?，取壓榨液?000轉(zhuǎn)／分轉(zhuǎn)速離心15分鐘，上清液用0.2M的pH5.6的乙酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)棺罱K體積的毫升數(shù)與所稱(chēng)取的豆芽莖克數(shù)相等，便得到原酶液，置冰箱貯存待用。3．試劑酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用0.2M的pH5.6乙酸鹽緩沖液稀釋10－20倍。5mM磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)：精確稱(chēng)取磷酸苯二鈉(C6H6Na2PO4·2H2O，分子量254.10)2.54克，加蒸餾水溶解后定容至100毫升，即配成了100mM磷酸苯二鈉水溶液，密閉保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)用0.2M的pH5.6的乙酸鹽緩沖液稀釋20倍，即得5mM磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)。(3)0.2M的pH5.9乙酸鹽緩沖液(4)福林-酚試劑：于2000毫升磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉（Na2WO4?2H2O）100克，鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）25克，水700毫升，85%磷酸50毫升，濃鹽酸100毫升。微火迴流10小時(shí)后加入硫酸鋰150克，蒸餾水50毫升和溴數(shù)滴搖勻。煮沸約15分鐘，以驅(qū)逐殘溴，溶液呈黃色，輕微帶綠色，（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。冷卻后定溶到1000毫升。過(guò)濾，置于棕色瓶中可長(zhǎng)期保存。臨用時(shí)，用蒸餾水稀釋3倍。(5)1M碳酸鈉溶液(6)0.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：精確稱(chēng)取分析純的酚結(jié)晶0.94克溶于0.1N的HCl溶液中，定容至1000毫升，即為酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液，貯存于冰箱可永久保存，此時(shí)的酚濃度約為0.01M。臨用時(shí)將上述的酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液用蒸餾水稀釋25倍，即得到0.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。四、操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取試管6支，按0到5的順序逐管編號(hào)，空白為0號(hào)。按照下表的要求，向各試管中依次加入0.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、0.2M的PH5.6的乙酸鹽緩沖液、1M碳酸鈉溶液和福林-酚試劑，注意加樣順序不得搞錯(cuò),否則顯不了色。搖勻，在350C保溫10分鐘以上（先用燒杯盛350C的水，置于水浴鍋中，再將試管放入燒杯中保溫，以防試管滑落入水中），以0號(hào)試管為空白，在可見(jiàn)光分光光度計(jì)上680納米波長(zhǎng)處讀取各管的吸光度A680，以A680為橫坐標(biāo)、酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)為縱坐標(biāo)作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，它應(yīng)該是一條直線。試管1234500.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（ml）0.10.20.30.40.500.2M的PH5.6的乙酸鹽緩沖液(ml)0.90.80.70.60.511M碳酸鈉溶液(ml)5福林-酚試劑（ml）0.5搖勻，在350C保溫顯色10分鐘A68002.酶活力的測(cè)定取2支試管，編號(hào)1’、0’，將0’號(hào)試管作為空白。在2支試管中各加入0.5ml的5mM磷酸苯二鈉溶液，350C預(yù)熱2分鐘，再向1’號(hào)試管中加入350C預(yù)熱過(guò)的酶液0.5ml，立即計(jì)時(shí)，搖勻，350C精確反應(yīng)10分鐘（酶液加入時(shí)為起始時(shí)間，碳酸鈉溶液加入時(shí)為終止時(shí)間）后立即向2支試管中各加入1M碳酸鈉溶液5ml，再各加入福林—酚稀溶液0.5ml，混勻，最后向0’號(hào)試管中加入酶液0.5ml，2支試管搖勻后在350C保溫顯色約10分鐘以上，將0’號(hào)試管作為空白，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)1號(hào)試管在680nM處的光吸收值A(chǔ)680，詳細(xì)的加樣順序和操作見(jiàn)下表：注意加樣順序不得搞錯(cuò),否則顯不了色。管號(hào)1’0’5mM磷酸苯二鈉溶液（ml）0.50.5350C預(yù)熱2分鐘酶液（350C預(yù)熱過(guò)的）（ml）一加入就計(jì)時(shí)0.50搖勻，350C精確反應(yīng)10分鐘后立即各加入1M碳酸鈉溶液5m（終止反應(yīng)用）福林—酚稀溶液（ml）0.50.50號(hào)試管加入酶液0.5ml搖勻，350C保溫顯色10分鐘以上A68003.酶活力的計(jì)算酶活力單位的定義為：在酶反應(yīng)的最適條件下每分鐘生成1微摩爾(μmole)產(chǎn)物所需要的酶量規(guī)定為一個(gè)活力單位。用1號(hào)試管的A680在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)c，根據(jù)下式可計(jì)算出1ml酶液中所含有的酶的活力為：2*0.4*c*1000/104.將試管清洗干凈，并注意清潔使用過(guò)的分光光度計(jì)和自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。記錄與計(jì)算匯總試管123451’A680C1ml酶液的活力實(shí)驗(yàn)七.血糖的定量測(cè)定Hagedorn-Juensen二氏定糖法目的學(xué)習(xí)用Hagedorn-Juensen二氏微量滴定法測(cè)定血糖含量。原理動(dòng)物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量較恒定。健康家兔的血糖水平為800-1200微克/毫升（即0.08%-0.12%）。用硫酸鋅和氫氧化鈉除去被檢血中的蛋白質(zhì)制成無(wú)蛋白血濾液。當(dāng)將血濾液與標(biāo)準(zhǔn)鐵氰化鉀溶液共熱時(shí)，一部分鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，并與鋅離子生成不溶性化合物。向混合液中加入碘化物后，用硫代硫酸鈉溶液滴定所釋放的碘。即可知剩余的鐵氰化鉀量。血糖越多，剩余的鐵氰化鉀越少，所消耗的硫代硫酸鈉也越少。硫代硫酸鈉溶液用量與血糖濃度的關(guān)系可以由經(jīng)驗(yàn)確定下來(lái)的數(shù)字表查出。此過(guò)程可用反應(yīng)式表示如下：1.還原反應(yīng)：K3Fe（CN）6+糖→K4Fe（CN）6+糖的氧化產(chǎn)物。2K4Fe（CN）6+3ZnSO4→K2Zn3[Fe（CN）6]2↓+3K2SO4由于產(chǎn)生不溶性化合物，糖的還原反應(yīng)進(jìn)行得比較完全。2.用碘量法測(cè)定剩余的標(biāo)準(zhǔn)K3Fe（CN）6溶液：2K3Fe（CN）6+2KI+8CH3COOH→2H4Fe（CN）6+I2+8CH3COOK2Na2S2O3+I2→2NaI+Na2S4O6器材1.微量進(jìn)樣器（100微升）2.微量滴定管（5毫升）3.水浴鍋。4.大試管5.錐形瓶（100ml）6.漏斗7.滴定管8.其他器材：普通試管，濾紙，吸管，鐵架臺(tái)，固定夾，漏斗等。試劑1.0.45%硫酸鋅溶液（新鮮配制）250毫升2.0.1摩爾/升氫氧化鈉溶液（新鮮配制）50毫升3.0.0005當(dāng)量/升鐵氰化鉀堿性溶液100毫升用分析天平稱(chēng)化學(xué)純鐵氰化鉀165克，溶解后加入預(yù)先準(zhǔn)備好的煅制無(wú)水碳酸鈉10.6克，定容到1升。將溶液放在棕色瓶?jī)?nèi)，于陰暗處保存。臨用時(shí)稀釋1000倍4.氯-鋅-碘溶液200毫升取硫酸鋅50克及純氯化鈉250克，定容到1升，作為母液。臨用前根據(jù)所需用的試劑量加入碘化鉀，使它在混合液中的濃度為25克/升。5.標(biāo)準(zhǔn)0.0005當(dāng)量/升硫代硫酸鈉溶液360毫升臨用時(shí)由標(biāo)準(zhǔn)0.1當(dāng)量/升硫代硫酸鈉溶液稀釋。6．3%醋酸溶液（不應(yīng)含鐵）100毫升7．1%可溶性淀粉溶液20毫升1克可溶性淀粉溶于10毫升沸水中，然后加入到90毫升飽和氯化鈉溶液中。此溶液可作為大多數(shù)碘量法滴定的指示劑，可長(zhǎng)期保存。操作實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)將水浴鍋加熱至沸騰（即設(shè)置在100度，水浴鍋的使用參見(jiàn)“粗脂肪的測(cè)定”）1.取二只試管，每一只用進(jìn)樣器加入0.45%硫酸鋅5毫升及0.1摩爾/升氫氧化鈉溶液1毫升，混勻，此時(shí)產(chǎn)生氫氧化鋅膠狀沉淀。2.用進(jìn)樣器精確地吸取血樣100微升，注入一個(gè)裝有氫氧化鋅的試管中，另一試管中加入100微升蒸餾水為對(duì)照管。3.將兩個(gè)試管同時(shí)放入盛有沸水的燒杯中，置于100度的恒溫水浴鍋中煮沸四分鐘，后用濾紙分別過(guò)濾到另外兩個(gè)錐形瓶中，用蒸餾水沖洗原來(lái)的試管兩次，每次用水3毫升，并用此水沖洗濾渣。4.用進(jìn)樣器向每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)精確地加入標(biāo)準(zhǔn)鐵氰化鉀堿性溶液2毫升，放入沸水浴中煮沸15分鐘（沸水浴操作同3.）。5.然后分別加入氯-鋅-碘溶液3毫升及3%醋酸2毫升，混勻。各加淀粉兩滴，稍等片刻，便顯藍(lán)色。用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉滴定至藍(lán)色消失為止。記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉毫升數(shù)。6.徹底清洗所使用過(guò)的所有玻璃儀器，倒置在桌面上，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。計(jì)算血糖含量（mol/L）的計(jì)算公式為：0.005*（2-x）其中x（ml）是樣品滴定值與對(duì)照滴定值之差，注意，對(duì)照滴定值大于樣品滴定值。如換算成葡萄糖的含量（g/100ml），則上面公式變形為：0.096*（2-x）記錄與計(jì)算匯總對(duì)照滴定值（ml）樣品滴定值（ml）x（ml）血糖含量（mol/L）相當(dāng)于葡萄糖的含量（g/100ml）實(shí)驗(yàn)八.米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)的測(cè)定一、目的學(xué)習(xí)和掌握米氏常數(shù)(Km)及最大反應(yīng)速度(Vm)的測(cè)定原理和實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)出酸性磷酸酯酶在以磷酸苯二鈉為底物時(shí)的Km和Vm。二、原理根據(jù)酶與底物形成中間絡(luò)合物的學(xué)說(shuō)，可以得到一個(gè)表示酶反應(yīng)速度與底物濃度之間相互關(guān)系的方程式，這就是酶學(xué)上著名的米氏方程式：式中，[S]為底物濃度，ν為反應(yīng)速度，Vm為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)，從米氏方程式可見(jiàn)：當(dāng)時(shí)，這時(shí)顯然，米氏常數(shù)Km，等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，米氏常數(shù)的單位就是濃度單位(M或mM)。測(cè)定Km和Vm，特別是測(cè)定Km，是酶學(xué)工作的基本內(nèi)容之一。在酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的分析中，米氏常數(shù)km是酶的一個(gè)基本的特性常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。特別是同一種酶能夠作用于幾種不同的底物時(shí)，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力強(qiáng)弱，Km數(shù)值越大，說(shuō)明酶與底物的親和力越弱；反之，Km值越小，說(shuō)明朗與底物的親和力越強(qiáng)。測(cè)定Km和Vm，一般通過(guò)作圖法求得。作圖方法很多，其共同特點(diǎn)是先將米氏方程式變換成其它數(shù)學(xué)形式，然后通過(guò)作圖法求得。本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定酸性磷酸酯酶以磷酸苯二鈉為底物的Km和Vm時(shí)，采用最常用的雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver—Burk作圖法）。這個(gè)方法是先將米氏方程轉(zhuǎn)換成倒數(shù)形式，即 然后以對(duì)作圖，可得到一條直線。這條直線在橫軸上的截距為，在縱軸上的截距為，由此即可求得Km和Vm。三、儀器、材料和試劑1．主要儀器<1>.VIS-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì)操作指南：插上電源插頭，打開(kāi)儀器右側(cè)面下方的電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)“波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕”使波長(zhǎng)顯示窗中的數(shù)字為所需的波長(zhǎng)（本實(shí)驗(yàn)為680納米），推開(kāi)比色室的蓋子。將空白和樣品溶液分別仔細(xì)倒入比色皿中（倒入之前先用少量溶液潤(rùn)洗比色皿一次），用衛(wèi)生紙擦去比色皿表面的余液，然后將比色皿插入比色室里的卡座中，拉動(dòng)卡座拉桿，將空白液的比色皿置于光路中。按一下“MODE”鍵，使“%T”的指示燈亮，在比色室的蓋子打開(kāi)的狀態(tài)下按一下“0%T”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為0.000。關(guān)閉比色室的蓋子，按一下“100%TABSO”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為100.0。這樣，儀器就調(diào)整好了。再按一下“MODE”鍵，使“ABS”指示燈亮，按一下“100%TABSO”鍵，使顯示窗中的數(shù)字為0.000。拉動(dòng)卡座拉桿，將樣品液的比色皿置于光路中，此時(shí)，顯示窗中的數(shù)字即為樣品的吸光度。按一下“PRINT”鍵，將測(cè)定結(jié)果打印出來(lái)。測(cè)定完后，將比色皿中的溶液倒入廢液缸（自帶）中，用蒸餾水（洗瓶）潤(rùn)洗3次，裝入盒中。注意保持分光光度計(jì)的比色室內(nèi)始終干燥干凈，嚴(yán)禁將溶液灑落比色室。不測(cè)定時(shí)，請(qǐng)將比色室的蓋子打開(kāi)。關(guān)于比色皿：比色皿的前后有2個(gè)光滑面，是用來(lái)對(duì)準(zhǔn)光路的，左右有2個(gè)粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接觸光滑面。比色皿的內(nèi)部的清洗只能用蒸餾水潤(rùn)洗（用洗瓶），不可用衛(wèi)生紙或其它物品捅進(jìn)去擦洗，比色皿的2個(gè)光滑面一定要保持清潔，如發(fā)現(xiàn)有指紋或殘液，須用衛(wèi)生紙輕輕擦拭干凈。比色皿是成套發(fā)放的，嚴(yán)禁混用。<2>.HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋操作指南：向水浴鍋中注滿(mǎn)自來(lái)水，蓋好蓋子，插上電源。先將“設(shè)定/測(cè)溫”選擇開(kāi)關(guān)置于“設(shè)定”檔，調(diào)節(jié)“溫度設(shè)定”旋鈕使屏幕上的溫度顯示為所需的溫度（本實(shí)驗(yàn)為30度），此時(shí)黃燈亮，表示儀器正在加熱。然后將“設(shè)定/測(cè)溫”選擇開(kāi)關(guān)置于“測(cè)溫”檔，此時(shí)屏幕上的溫度顯示為實(shí)際水溫，當(dāng)實(shí)際水溫達(dá)到設(shè)定的溫度時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)恒溫，此時(shí)綠燈亮。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)該將恒溫水浴鍋的水溫調(diào)節(jié)好。<3>.試管架<4>.取樣器2只（1只1ml、1只5ml）<5>.試管14只2．材料酸性磷酸酯酶：稱(chēng)取一定量的綠豆，用稀鹽水(約0.9％)浸泡2小時(shí)。洗去鹽水后在25℃溫箱內(nèi)保持濕潤(rùn)，發(fā)芽4—5天。除去綠豆芽的根、頭部。稱(chēng)取豆芽莖，用研缽研磨，每10克豆芽莖加入2毫升0.2M的pH5.6的乙酸鹽緩沖液，置冰箱過(guò)夜。次日用紗布?jí)赫?，取壓榨液?000轉(zhuǎn)／分轉(zhuǎn)速離心15分鐘。上清液置透析袋對(duì)蒸餾水充分透析，間隔換水十次，透析時(shí)間24小時(shí)以上。透析后，如需要，用稀乙酸溶液調(diào)節(jié)至pH5.6，并進(jìn)行稀釋?zhuān)棺罱K體積的毫升數(shù)與所稱(chēng)取的豆芽莖克數(shù)相等；以3000轉(zhuǎn)／分轉(zhuǎn)速離心30分鐘左右，所得的澄清原酶液置冰箱貯存待用。3．試劑：(1)酸性磷酸酯酶酶液(Ⅳ)，取原酶酶液用0.2M的pH5.6乙酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)要求Lineweaver—Burk圖制作中第5管的A680。達(dá)到0.7—0.8左右，一般約稀釋10倍。(2)5mM磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)：精確稱(chēng)取磷酸苯二鈉(C6H6Na2PO4·2H2O，分子量254.10)2.54克，加蒸餾水溶解后定容至100毫升，即配成了100mM磷酸苯二鈉水溶液，密閉保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)用0.2M的pH5.6的乙酸鹽緩沖液稀釋20倍，即得5mM磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)。(3)0.2M的pH5.9乙酸鹽緩沖液(4)福林-酚試劑：于2000毫升磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉（Na2WO4?2H2O）100克，鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）25克，水700毫升，85%磷酸50毫升，濃鹽酸100毫升。微火迴流10小時(shí)后加入硫酸鋰150克，蒸餾水50毫升和溴數(shù)滴搖勻。煮沸約15分鐘，以驅(qū)逐殘溴，溶液呈黃色，輕微帶綠色，（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。冷卻后定溶到1000毫升。過(guò)濾，置于棕色瓶中可長(zhǎng)期保存。臨用時(shí)，用蒸餾水稀釋3倍。(5)1M碳酸鈉溶液(6)0.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：精確稱(chēng)取分析純的酚結(jié)晶0.94克溶于0.1N的HCl溶液中，定容至1000毫升，即為酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液，貯存于冰箱可永久保存，此時(shí)的酚濃度約為0.01M。臨用時(shí)將上述的酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液用蒸餾水稀釋25倍，即得到0.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。四、操作步驟1.酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)六，做過(guò)實(shí)驗(yàn)六的同學(xué)此步可免，直接應(yīng)用上次的酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。未做過(guò)實(shí)驗(yàn)六的同學(xué)，請(qǐng)按下述操作：取試管6支，按0到5的順序逐管編號(hào)，空白為0號(hào)。按照下表的要求，向各試管中依次加入0.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、0.2M的PH5.6的乙酸鹽緩沖液、1M碳酸鈉溶液和福林-酚試劑，注意加樣順序不得搞錯(cuò),否則顯不了色。搖勻，在350C保溫10分鐘以上（先用燒杯盛350C的水，置于水浴鍋中，再將試管放入燒杯中保溫，以防試管滑落入水中），以0號(hào)試管為空白，在可見(jiàn)光分光光度計(jì)上680納米波長(zhǎng)處讀取各管的吸光度A680，以A680為橫坐標(biāo)、酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)為縱坐標(biāo)作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，它應(yīng)該是一條直線。試管1234500.4mM酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（ml）0.10.20.30.40.500.2M的PH5.6的乙酸鹽緩沖液(ml)0.90.80.70.60.511M碳酸鈉溶液(ml)5福林-酚試劑（ml）0.5搖勻，在350C保溫顯色10分鐘A68002.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響—Km和Vm的測(cè)定：取試管7支，按照0至6的順序逐管編號(hào)，空白管為0號(hào)。1-6號(hào)管按下表加入不同體積的5mM磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)，并分別補(bǔ)充0.2MpH5.6乙酸鹽緩沖液至0.5毫升。35℃預(yù)熱2分鐘（先用燒杯盛350C的水，置于水浴鍋中，再將試管放入燒杯中保溫，以防試管滑落入水中），逐管加入35℃預(yù)熱過(guò)的酸性磷酸酯酶酶液(Ⅳ)0.5毫升，開(kāi)始計(jì)時(shí)，搖勻，精確反應(yīng)10分鐘（酶液加入時(shí)為起始時(shí)間，碳酸鈉溶液加入時(shí)為終止時(shí)間）。反應(yīng)時(shí)間到達(dá)后立即加入5毫升1M碳酸鈉溶液，再加入0.5毫升福林—酚稀溶液，搖勻，35℃保溫顯色約10分鐘。0號(hào)管內(nèi)先加入0.5毫升5mM磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)，再加入5毫升1M碳酸鈉溶液和0.5毫升福林—酚稀溶液，最后加入0.5毫升酶液(Ⅳ)，其它操作與1-6管相同。冷卻后以0號(hào)管作空白，在VIS-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì)680毫微米波長(zhǎng)處讀取各管的吸光度A680。整個(gè)操作過(guò)程見(jiàn)下表：管號(hào)12345605mM磷酸苯二鈉溶液(ml)0.10.140.20.250.330.50.50.2MpH5.6乙酸鹽緩沖液（ml）0.40.360.30.250.170035℃預(yù)熱2分鐘左右35℃預(yù)熱過(guò)的酶液(ml)（一加就計(jì)時(shí)）0.50.50.50.50.50.5暫不加搖勻，在35℃的條件下，精確反應(yīng)10分鐘（注意合理安排各試管的酶液加入時(shí)間，也就是反應(yīng)起始時(shí)間，最好相隔1分鐘）。各管內(nèi)均加入1M碳酸鈉溶液5毫升（用于終止反應(yīng)）各管內(nèi)均加入福林-酚稀溶液0.5毫升，搖勻向0號(hào)試管加入酶液0.5ml搖勻，所有試管在35℃保溫顯色10分鐘以上A6800用各管的A680在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)c，則產(chǎn)物的濃度為0.4*c，這樣，各種底物濃度下的速度ν＝0.4*c/10，取相應(yīng)的倒數(shù)，填入下表內(nèi)。以1／ν為縱座標(biāo)，1／[S]為橫座標(biāo)作圖，求出Km和Vm。3.將試管清洗干凈，并注意清潔使用過(guò)的分光光度計(jì)和自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收。記錄與計(jì)算匯總管號(hào)123456A680C磷酸苯二鈉濃度（mM）0.50.71.01.251.652.51/[S]2.01.421.00.80.60.4反應(yīng)時(shí)間（分鐘）101010101010ν(微克分子/ml*分)1/νKmVm實(shí)驗(yàn)九.酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作和初速度的測(cè)定一.目的通過(guò)進(jìn)程曲線的制作，求出酸性磷酸酯酶反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍。二.原理同實(shí)驗(yàn)六要進(jìn)行酶的活力測(cè)定，首先要確定酶的反應(yīng)時(shí)間。酶的反應(yīng)時(shí)間并不是任意規(guī)定的，應(yīng)該在初速度范圍內(nèi)進(jìn)行選擇。要求出代表酶反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍就必須制作酶反應(yīng)的進(jìn)程曲線。所謂進(jìn)程曲線是指酶反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量(或底物減少量)之間的關(guān)系曲線。它表明了酶反應(yīng)隨反應(yīng)時(shí)間變化的情況。本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程曲線是在酶反應(yīng)的最適條件下采用每間隔一定的時(shí)間測(cè)定產(chǎn)物生成量的方法，以酶反應(yīng)時(shí)間為橫座標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱座標(biāo)繪制而成的。從進(jìn)程曲線可以看出，曲線的起始部分在某一段時(shí)間范圍內(nèi)呈直線，其斜率代表酶反應(yīng)的初速度。但是，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線趨于平坦，曲線的斜率不斷下降，說(shuō)明反應(yīng)速度逐漸降低。反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低這一現(xiàn)象可能是由于反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)以后底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強(qiáng)等原因所引起的。因此，要真實(shí)反映出酶活力的大小，就應(yīng)該在產(chǎn)物生成量與酶反應(yīng)時(shí)間成正比的這一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行初速度的測(cè)定。換言之，測(cè)定酶活力應(yīng)該在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。制作進(jìn)程曲線，求出酶反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍是酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析中的組成部分和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。三、儀器、材料和試劑1．主要儀器<1>.VIS-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì)操作指南：插上電源插頭，打開(kāi)儀器右側(cè)面下方的電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)“波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕”使波長(zhǎng)顯示窗中的數(shù)字為所需的波長(zhǎng)（本實(shí)驗(yàn)為680納米），推開(kāi)比色室的蓋子。將空白和樣品溶液分別仔細(xì)倒入比色皿中（倒入之前先用少量溶液潤(rùn)洗比色皿一次），用衛(wèi)生紙擦去比色皿表面的余液，然后將比色皿插入比色室里的卡座中，拉動(dòng)卡座拉桿，將空白液的比色皿置于光路中。按一下“MODE”鍵，使“%T”的指示燈亮，在比色室的蓋子打開(kāi)的狀態(tài)下按一下“