細(xì)胞內(nèi)微泡形成的分子機(jī)制

細(xì)胞內(nèi)微泡形成的分子機(jī)制

囊泡概念和細(xì)胞外科醫(yī)生物化學(xué)價值一、evs的分類esr是一個由細(xì)胞源的雙分子層組成的球形膜層，包括通常提到的微氣泡和外部體。EVs是一組直徑介于40~5000nm間的囊泡狀小體,多種細(xì)胞均可向其生存的微環(huán)境中分泌EVs。EVs可攜帶多種生物活性物質(zhì),如蛋白酶、各種生長因子及受體、組蛋白、mRNA、miRNA及起源細(xì)胞的分子標(biāo)志等,并把這些生物活性物質(zhì)由起源細(xì)胞轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞。由于EVs是一組異質(zhì)性較大的群體,因而有很多描述EVs的術(shù)語,如外來體、微泡、膜性顆粒、納米顆粒、微粒體、凋亡小體、致癌小體(來源于腫瘤細(xì)胞的外來體)、形似外來體的囊泡等。但這些術(shù)語易引起歧義,而外來體和微泡正逐漸被廣大學(xué)者接受和使用,且歧義較少。目前,依據(jù)微泡的不同起源可將EVs分為3種類型,即脫落微泡、外來體和凋亡小體,其各類型的特征詳見(見表1)。目前發(fā)現(xiàn),多種類型的細(xì)胞都能產(chǎn)生EVs,包括各種造血系統(tǒng)的細(xì)胞,如血小板、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞,網(wǎng)織紅細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。多種干細(xì)胞和前體細(xì)胞,如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及多種細(xì)胞株在體內(nèi)、外均可產(chǎn)生微泡。最新研究證實(shí),非造血器官中的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞也可分泌EVs,如肺泡上皮細(xì)胞。微泡主要存在于細(xì)胞生存的微環(huán)境中,目前已能從細(xì)胞培養(yǎng)的上清液及各種體液(如血漿、血清、唾液、乳汁和尿液等)中成功分離出EVs。研究發(fā)現(xiàn),多種機(jī)制參與了EVs的形成,脫落囊泡的形成與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度密切相關(guān),且在脫落囊泡形成的過程中可能有膜受體的參與,進(jìn)而引起細(xì)胞膜的重構(gòu)和囊泡脫落。外來體的形成不僅依賴胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,還可能與細(xì)胞表面各種受體的活化密切相關(guān)。在一定條件下,細(xì)胞可自發(fā)分泌外來體,如腫瘤細(xì)胞株和EBV感染的B淋巴細(xì)胞等。刺激EVs形成的其他因素還包括細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞活化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞死亡和(或)凋亡、細(xì)胞損傷(如放射損傷)等。二、囊泡在免疫治療中的重要作用EVs所包含的物質(zhì)與其類型及起源密切相關(guān),因而不同類型和起源的囊泡功能也有所不同。目前研究發(fā)現(xiàn),EV可在各種生理和病理生理?xiàng)l件下傳遞細(xì)胞間信息,即通過傳遞遺傳物質(zhì)、轉(zhuǎn)移受體、信號分子等方式影響其他細(xì)胞。囊泡在免疫反應(yīng)、生理穩(wěn)態(tài)維持、血管生成、血栓形成及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。目前,大量研究都試圖通過分析各種生理和病理?xiàng)l件下囊泡發(fā)揮信息傳遞作用的具體分子機(jī)制,來闡明其病理生理過程,并期望能將囊泡作為將來治療各種疾病的靶點(diǎn)或早期診斷的生物標(biāo)志。Grang等的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),腎癌干細(xì)胞來源的微泡能促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。Dai等的一項(xiàng)研究已經(jīng)將腹水來源的微泡用于結(jié)腸直腸癌的免疫治療。Mitchell等的研究發(fā)現(xiàn),根據(jù)血流中微泡所含miRNA種類和含量的不同可對特定人群進(jìn)行早期的腫瘤篩查。evs分離和純化目前已開發(fā)出了很多分離和純化EVs的技術(shù)和方法,如差速離心法、蔗糖密度梯度離心法、抗體標(biāo)記的磁珠分選、微孔過濾技術(shù)、ExoQuickTM試劑盒和微流控技術(shù)等。但是在目前最大的問題是缺乏標(biāo)準(zhǔn)且高效的EVs分離方法和技術(shù)?，F(xiàn)有的EVs分離和純化方法在實(shí)際應(yīng)用中均存在較多的缺點(diǎn)和限制。以下主要探討目前EVs的各種分離和純化方法,及每種方法在實(shí)際應(yīng)用過程中的優(yōu)缺點(diǎn)。一、超高速離心目前,差速離心法被認(rèn)為是分離EVs的標(biāo)準(zhǔn)方法,且已被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液和各種體液中囊泡的分離。盡管不同單位的分離步驟有所差異,但主要有以下幾個步驟。(1)首先是低速離心,一般轉(zhuǎn)速為300×g,離心10min,此步驟是為了去除細(xì)胞。(2)再把上清液高速離心,轉(zhuǎn)速在(2000~10000)×g間,隨轉(zhuǎn)速的增加,離心時間可適當(dāng)縮短,一般為10000×g離心30min,此步驟主要為了去除死亡的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片。(3)最后為超高速離心,即對前述的上清液進(jìn)行超高速離心,轉(zhuǎn)速通常為100000×g,一般離心70min。若想去除蛋白質(zhì)的干擾得到較高純度的EVs,可在超高速離心后用大量PBS緩沖液重懸,然后重復(fù)超高速離心,再棄去上清后用適量PBS緩沖液重懸,即為分離所得的EVs。將其放置到-80℃的冰箱內(nèi)保存(可保存1年,切忌反復(fù)凍融),以備后續(xù)檢測和使用。以上所有離心步驟均在4℃條件下進(jìn)行。然而,差速離心分離法所需時間較長,一般需要4~5h;且分離過程中需要超高速離心,此步驟對EVs數(shù)量影響較大,因而分離得到的EVs的產(chǎn)率較低。此外,該方法分離得到的EVs的純度也較低,常混有蛋白質(zhì)和核酸碎片等雜質(zhì)。待分離樣本的黏度也會影響EVs的產(chǎn)率,可將黏度較高的液體進(jìn)行適當(dāng)稀釋,然后再按照上述步驟進(jìn)行分離。雖然分離純化后的EVs數(shù)量可在室溫下保持3~4d不變,但一般建議儲存在-80℃冰箱中;反復(fù)凍融對EVs活性和數(shù)量影響較大,每凍融一次,EVs的數(shù)量會損失10%~15%。二、蔗糖分離步驟為去除差速離心法得到EVs中混有的蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì),可用蔗糖密度梯度離心,其能依據(jù)不同物質(zhì)浮選密度的不同進(jìn)一步純化EVs。外來體在蔗糖梯度溶液中的浮選密度為1.08~1.22g/mL,而微泡的浮選密度為1.18~1.25g/mL。故可根據(jù)需要配置上述不同密度的蔗糖溶液,盡管不同單位的分離步驟有所差異,但主要包括以下幾個步驟。首先是用25mL的PBS緩沖液重懸差速離心法得到的EVs,并加入約4mL適當(dāng)濃度的蔗糖溶液至離心管中;將EVs稀釋液緩緩加入到蔗糖溶液界面的上方,4℃下進(jìn)行100000×g高速離心70min;離心結(jié)束后,用5mL注射器抽取約3.5mL的蔗糖溶液,并轉(zhuǎn)移至超速離心管中,并用PBS稀釋至60mL,然后再次離心,4℃下100000×g離心70min;最后棄去上清液,并用50~100μL的PBS液重懸,所得即為EVs。三、差速離心法微孔過濾技術(shù)是近年剛開發(fā)的一項(xiàng)分離EVs的新技術(shù)。常與差速離心法配合使用,用于取代差速離心法中前兩步的離心步驟,其作用也是為了清除死亡細(xì)胞、較大的細(xì)胞碎片和凋亡顆粒。雖然微孔分離技術(shù)與差速離心聯(lián)合能縮短EVs分離所需時間,但該方法會降低EVs的產(chǎn)率,且分得EVs中混有較多的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。四、胞來源的evs分離關(guān)于EVs蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),EVs可表達(dá)一些囊泡共有蛋白和細(xì)胞特異性的蛋白,而這些蛋白可作為分子標(biāo)志用于EVs的分離。目前,使用抗體包被的免疫磁珠已能成功分離多種細(xì)胞來源的EVs,其分離方法主要包括以下幾個步驟。首先把待測樣本(一般為2mL)與標(biāo)記目標(biāo)EV抗體的免疫磁珠(一般約50μL)混勻,在室溫下置于搖床上孵育2h;再把分離柱放到分離器的磁鐵架上,并用500μL的PBS潤洗分離柱;然后將孵育結(jié)束后的待分離樣本緩緩加入到分離柱中,棄去廢液;將分離柱移出磁性分離器;最后用PBS沖洗分離柱,收集沖洗分離柱所得到的液體,即為含有目標(biāo)EVs的液體。但用此方法分離得到的EVs活性受到一定影響,不利于后續(xù)的EVs的功能分析和研究,且不適用于大體積樣本的分離。五、微流控裝置工作原理微流控技術(shù)是一種在微觀領(lǐng)域研究和操控液體流動的技術(shù)。這種微流控技術(shù)和微型化的芯片裝置對于臨床診斷和血液分析非常有用。微流控裝置可利用EVs與抗體包被界面的特異性結(jié)合來分離EVs,將待測樣本加入裝置后,裝置內(nèi)微型泵促使液體流過芯片,在流動過程中達(dá)到分離EV的目的。使用此技術(shù)的設(shè)備結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具體詳細(xì)步驟不再論述。該分離EVs的方法具有快捷、省時、高效的特點(diǎn),但不適合體積較大樣本的分離,一般每小時僅能分離400~500μL樣本。六、誤吸分離試驗(yàn)?zāi)壳?許多國際知名的生物科技公司都在競相開發(fā)能從各種體液中快速、簡單地分離EVs的方法。目前最成熟的是由美國Biosciences公司生產(chǎn)的ExoQuickTM試劑盒。使用此試劑盒能夠克服差速離心法耗時較長和所得EVs純度低的缺點(diǎn)。Taylor等分析并比較了各種EVs分離的方法,發(fā)現(xiàn)使用ExoQuickTM試劑盒分離得到的EVs中所含miRNA的純度和數(shù)量要高于其他方法。但目前仍需進(jìn)一步研究以證實(shí)此類試劑盒的適用性。evs的分離與純化目前對于EVs研究有了一些進(jìn)展,對微泡的起源、組分及其部分功能有了初步了解,微泡在疾病診斷和治療方面的作用已嶄露頭角。Fleitas等的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),血流中的微泡和內(nèi)皮細(xì)胞可作為判斷終末期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后指標(biāo)。Rank等的研究發(fā)現(xiàn),血漿中紅細(xì)胞來源的微泡有助于異基因造血干細(xì)胞移植后急性移植物抗宿主病的診斷。Cantalupp等的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮前體細(xì)胞來源的微泡有助于保護(hù)腎臟的缺血再灌注損傷。在中風(fēng)動物模型研究中發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞來源的囊