魚腥草注射液抗炎和絕熱作用的實驗研究

魚腥草注射液抗炎和絕熱作用的實驗研究

魚糞草注射液作為一種廣泛使用的中藥方劑，具有清熱解毒、消膿、排膿、補水通淋的功效。臨床上主要用于呼吸道感染、尿道感染、婦科感染等疾病的綜合治療。隨著該藥的廣泛應(yīng)用,其嚴(yán)重不良反應(yīng),如過敏性休克、死亡,引起了各界高度重視,已被暫停生產(chǎn)、使用。本課題組前期進(jìn)行的豚鼠、Beagle犬和食蟹猴的類過敏和過敏試驗中均發(fā)現(xiàn)魚腥草注射液原制劑所含增溶劑聚山梨酯80(polysorbate80,Tween80)具有致敏性。經(jīng)過大量文獻(xiàn)調(diào)研和增溶劑優(yōu)選試驗研究,選用新增溶劑羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD),通過對魚腥草原料藥、中間產(chǎn)物及中試產(chǎn)品的全程質(zhì)量控制,改進(jìn)生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),研制成魚腥草注射液新制劑。前期進(jìn)行的Beagle犬和食蟹猴類過敏和過敏試驗結(jié)果顯示新制劑無明顯致敏性,解決了魚腥草注射液的主要安全性問題。本研究在以往工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究NYI的抗炎、解熱作用及其影響因子,并與OYI作用進(jìn)行比較,現(xiàn)報道如下。材料表面1大耳白兔1ICR小鼠300只,SPF級;SD大鼠100只,體重160～190g;日本大耳白兔90只,體重為2～2.5kg,以上實驗動物均為雄性,均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證編號:SCXK(京)2007-0001。實驗環(huán)境室溫度10～16℃,相對濕度為40%～55%。2注射用賴氨匹林氫化可的松注射液(規(guī)格:5mL∶25mg,天津金耀氨基酸有限公司,批號:0612212,);注射用賴氨匹林(規(guī)格:0.9g·瓶-1,安徽豐原藥業(yè)股份有限公司涂山藥廠,批號:080109);魚腥草注射液原制劑(OYI):含0.5%Tween80,批號為K080501;魚腥草注射液新制劑(NYI):含0.4%HP-β-CD,批號為K080907,均由四川雅安三九制藥集團(tuán)提供。3酶標(biāo)儀8mm打孔器(東莞市長安巨豐五金制品廠);電子天平10d(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);UV8453型分光光度計(美國Agilent公司);IECCL31R離心機(jī)(美國ThermoFisherScientific公司);MC141W型OMRON電子體溫計(大連歐姆龍有限公司);HERMOMULTISKANMK3全自動酶標(biāo)儀(美國熱電公司)。二甲苯(分析純,規(guī)格為500mL·瓶-1,批號:9004261,北京五二九五二化工廠生產(chǎn));伊文思藍(lán)(規(guī)格:1g·瓶-1,批號:E2129,貨號:E8010,Sigma公司生產(chǎn));冰醋酸(500mL·瓶-1,批號:20081107,北京試劑廠生產(chǎn));干酵母片(規(guī)格為每袋0.2g×80片,批號:0812023,廣東五洲藥業(yè)有限公司);大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS055∶B5,批號:L2880,Sigma公司生產(chǎn))。RabbitPGE2ELISA試劑盒,96T,貨號:5B640;RabbitELISAIL-1β試劑盒,96T,貨號:5R034;RabbitIL-8ELISA試劑盒,96T,貨號:5R044;RabbitTNF-αELISA試劑盒,96T,貨號:5R022,均購自Sunbio公司,美國RB(Rapidbio)公司分裝。方法1小鼠右耳正反兩面致炎試驗雄性ICR小鼠180只,體重為27～30g,隨機(jī)分為6組:模型對照組,氫化可的松組(25mg·kg-1),OYI組(30mL·kg-1),NYI高劑量組(NYI-H組,30mL·kg-1),中劑量組(NYI-M組,15mL·kg-1)和低劑量組(NYI-L組,7.5mL·kg-1),每組30只。將0.025mL二甲苯均勻涂于小鼠右耳正反兩面致炎,左耳不涂,為正常耳。造模后立即靜脈注射各劑量藥物,給藥后1.5h脫頸處死小鼠,沿耳廓基線剪下兩耳,用8mm打孔器沖下左耳和右耳同一部位的圓片,于電子天平上稱重,以左右兩耳重量差表示腫脹度,并計算腫脹率和腫脹抑制率。2透氣性抑制率測定雄性ICR小鼠100只,體重為18～21g,分組及給藥劑量同“1”項,每組16只。靜脈給藥后30min,尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液(0.1mL/10g體重),腹腔注射0.8%乙酸生理鹽水溶液(0.1mL/10g體重),30min后,斷頸處死,剪開腹膜,用8mL生理鹽水沖洗腹腔,收集洗液,4℃,2500r·min-1離心10min,取上清液于590nm處測定吸光度值(A),增加并計算通透性抑制率(%)。3動物分組、模型被試和模型處理雄性SD大鼠100只,體重160～190g,每日測肛溫1次,連續(xù)3d,使大鼠適應(yīng)此測溫操作。選擇體溫范圍在37.0～38.0℃,且體溫波動在0.5℃以內(nèi)的84只大鼠用于實驗。隨機(jī)分為7組,分別為正常對照組、模型對照組、賴氨匹林注射液組(200mg·kg-1),OYI組(20mL·kg-1),NYI高劑量組(NYI-H組,20mL·kg-1)、中劑量組(NYI-M組,10mL·kg-1)和低劑量組(NYI-L組,5mL·kg-1),每組12只。實驗當(dāng)日早晨先測動物基礎(chǔ)體溫,然后以15%的酵母混懸液按1mL/100g背部皮下注射復(fù)制發(fā)熱模型。造摸后3h,各給藥組分別靜脈給藥1次,模型組在同等條件下給予同體積生理鹽水。在復(fù)制發(fā)熱模型后2,3,4,6,8,10h及給藥后即刻,1,3,5,7h測量肛溫(造模3,4,6,8,10h與藥后即刻,1,3,5,7h為重合時間點),以不同時間所測肛溫與各基礎(chǔ)肛溫的差值為體溫變化的指標(biāo)。4家兔進(jìn)行內(nèi)毒素檢測,造模方法及過程日本大耳白兔90只,實驗前3d預(yù)測體溫,體溫在38.0～39.0℃,波動在0.4℃以內(nèi)者為合格家兔,連續(xù)3d測得的肛溫值為基礎(chǔ)肛溫。將77只合格家兔按體重分層,隨機(jī)分為7組,分別為正常對照組、模型對照組、賴氨匹林組(180mg·kg-1),OYI組(10mL·kg-1),NYI高劑量組(NYI-H組,10mL·kg-1)、中劑量組(NYI-M組,5mL·kg-1)和低劑量組(NYI-L組,2.5mL·kg-1),每組11只。實驗日測定家兔體溫后,各家兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)0.5μg·mL-1(1mL·kg-1),正常對照組則注入等劑量無菌生理鹽水,全部過程均無菌操作。造模后立即耳靜脈注射給藥。給藥后0.5,1,2,3,4,5,6h測家兔體溫。連續(xù)觀察藥后各時段體溫變化值。于造模后2h,從清醒家兔耳緣中動脈抽血3mL,放置1～2h后,4℃,3000r·min-1離心10min,取血清,-20℃保存。采用雙抗夾心ELISA法,參照試劑盒說明書測定IL-1β,IL-8,TNF-α,PGE2含量。5統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用ˉx±s和百分率表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異性比較。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1高、中劑量niii對niii表達(dá)的抑制作用NYI的高、中劑量對二甲苯誘發(fā)小鼠耳腫脹均有抑制作用。高、中劑量NYI與模型對照組相比有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。與OYI相比,NYI組的抑制耳腫脹作用無明顯差異。見表1。2niii對k-l-i表達(dá)的影響NYI的高、中、低劑量組對醋酸導(dǎo)致的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)均有抑制作用。其中高、中、低劑量與模型對照組相比均有顯著差異。與OYI相比,NYI的抑制腹腔通透性的作用較強(qiáng),但二者抑制作用無明顯差異。NYI和OYI對乙酸導(dǎo)致的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)影響的比較結(jié)果見表2。3造模前后動物體溫的變化各組大鼠在造模后1～2h,體溫明顯地低于基礎(chǔ)體溫,此后逐漸回升。造摸后3h,各組動物體溫上升幅度穩(wěn)定均一,故決定造模后3h尾靜脈注射給藥。模型組動物3～6h體溫顯著升高,6h達(dá)到高峰,此后體溫逐漸平緩下降。結(jié)果顯示,NYI高劑量組在給藥后1～3h出現(xiàn)明顯的降低體溫作用,與OYI相比無顯著性差異。見表3。4內(nèi)毒素對蠶桑發(fā)燒的影響4.1第3h左右穩(wěn)定各組動物在造模后體溫即開始上升,至1～2h左右達(dá)到高峰,此后體溫穩(wěn)定與此,至第3h左右再度升高且超過第一個體溫高峰,此后逐漸下降。結(jié)果顯示,OYI有顯著的解熱作用(P<0.01),NYI高劑量也有明顯抑制體溫升高的作用(P<0.05),兩者相比無顯著性差異。見表4。4.2ooi和高劑量niii對il-8和pge2含量的影響結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組的血清中TNF-α,IL-1β,IL-8和PGE2的含量顯著增加(P<0.01)。OYI和高劑量NYI均能明顯降低TNF-α,IL-1β,IL-8,PGE2的含量。與模型對照組比較,均有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),兩者比較無顯著性差異。見表5。魚腥草制劑的藥效學(xué)作用魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜(HouttuyniacordataThunb)的全草,具有清熱解毒、消腫排膿、利尿涌淋的功效,主要應(yīng)用于治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢熱淋、痛腫瘡毒等病證。魚腥草中主要含有揮發(fā)油和黃酮類化合物。從魚腥草中提取的精油中分離出抗菌活性的成分癸酰乙醛(decanoylacetaldehyde)與月桂醛(laurinaldehyde)均有特異臭氣味。曾虹燕等認(rèn)為水蒸氣蒸餾所得的揮發(fā)油化學(xué)成分種類最多,其主要成分為甲基正壬酮、1-壬醇、癸醛、芳樟醇、癸酸等,其中甲基正壬酮含量占了近1/4,其他成分的相對含量較少。水蒸氣蒸餾的魚腥草揮發(fā)油不具腥味,不含癸酰乙醛,可能在加熱條件下,癸酰乙醛被氧化為癸酰乙酸,后者極易降解為甲基正壬酮。采摘鮮魚腥草24h內(nèi),采用水蒸氣重蒸餾法制備NYI,經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對其成分進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,主要含有2-甲基正壬酮、芳樟醇、萜品醇、(-)-冰片醋酸酯、癸酸等39種成分,其中以芳樟醇、4-萜品醇、α-萜品醇、(-)-冰片醋酸酯、2-甲基正壬酮、癸酸等6種成分含量相對較高,占提取總揮發(fā)油含量的70%。其中,2-甲基正壬酮、芳樟醇、冰片L、萜品醇具有抗菌、抗病毒作用;萜品醇還具有平喘止咳作用;香葉醇具有抗菌和提高機(jī)體免疫力作用。本實驗室近期進(jìn)行了NYI和OYI的抗病毒作用比較研究,主要采用甲型H1N1流感病毒FM1和PR8株體內(nèi)感染小鼠和免疫低下小鼠肺炎模型、體外細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法和神經(jīng)氨酸酶熒光測定法、病毒載量檢測和小鼠死亡保護(hù)4個實驗。結(jié)果顯示,魚腥草注射劑對流感病毒株FM1和PR8感染引起的小鼠肺部炎癥均有明顯治療和預(yù)防作用,降低H1N1病毒感染小鼠的肺指數(shù)和肺組織病毒載量,并能顯著降低肺炎小鼠的死亡率,增加小鼠的存活天數(shù)。同等劑量下,二者作用相當(dāng)。NYI和OYI對所試兩株病毒致CPE均未顯示出抑制作用,對流感病毒FM1株神經(jīng)氨酸酶活力未顯示出抑制作用。結(jié)合本研究結(jié)果,我們認(rèn)為中藥治療感染性疾患,強(qiáng)調(diào)通過“扶正”達(dá)到“祛邪”,即通過調(diào)整機(jī)體抗病能力(免疫、抗炎等多方面作用),而達(dá)到抑菌、抗病毒、緩解癥狀、促進(jìn)康復(fù)等治療作用,因而在實驗研究中,經(jīng)常是體內(nèi)實驗有效,而體外實驗效果欠佳或無效。這符合中藥研究中的普遍性規(guī)律,值得進(jìn)一步研究,特別是通過臨床研究來獲得可靠的結(jié)論。LPS作用于人體和動物,可以使單核-巨噬細(xì)胞釋放內(nèi)源性致熱源TNF-α,IL-1等,TNF-α通過直接刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞和刺激巨噬細(xì)胞釋放IL-1,IL-1促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞釋放PGE2(發(fā)熱的正調(diào)節(jié)介質(zhì)),刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞,引起發(fā)熱。IL-1,TNF和LPS均能誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成和分泌IL-8。IL-8水平升高往往與局部浸潤的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量相平行。在發(fā)熱和感染模型的早期血清或炎癥局部滲出液中都可檢測到IL-1,I