煙夜蛾基因18srdna序列克隆及序列分析

煙夜蛾基因18srdna序列克隆及序列分析

糖核糖體（ribosmalka）是糖核的主要成分，包括一個大亞甲基和一個小亞甲基。其中真核生物核糖體的小亞基RNA由染色體基因編碼,稱為18SrDNA基因(18SrRNA),它在蛋白質合成中具有重要的功能,常被作為蛋白質定量分析的內參基因(Suzukietal.,2000)。在漫長的生物進化過程中,由于18SrDNA基因的二級結構基本格局變化較少,核苷酸替換率較低,是至今發(fā)現(xiàn)的DNA序列中最為保守的一類。因此,18SrDNA基因是研究生命起源和早期生物進化、高級分類階元系統(tǒng)發(fā)育關系的主要分子標記,被認為是最有希望解決早期動物進化形式的工具(吳平等,2000)。研究表明18SrDNA基因具有豐富的生物學信息。應用于昆蟲高級階元系統(tǒng)分類后,不僅符合傳統(tǒng)分類的特征,也能解決一些傳統(tǒng)分類不能解決的問題,如用18SrDNA基因研究昆蟲各目間的關系,證明了鞘翅目不是一個單系,它與脈翅目、廣翅目和蛇蛉目為姐妹群(Carmeanetal.,1992;Pashleyetal.,1993;Whitingetal.,1997);在進化關系上捻翅目與彈尾目比較接近(王瑛等,1999),鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和膜翅目比較接近(魏國清等,2006)。在目以下分類階元的研究方面,目前主要集中在鞘翅目、半翅目、同翅目、直翅目和膜翅目,利用部分18SrDNA基因片斷探討亞目或總科、科的系統(tǒng)發(fā)育關系(Caterinoetal.,2002;Marvaldi,2002;Bourgoin,1997;Martinetal.,1993;李紅梅等,2006;劉殿鋒等,2005;柳娟娟,2007),但研究結果受所選取基因片斷影響較大。近年來,隨著昆蟲分子生物學研究的不斷深入,一些昆蟲的18SrDNA全序列不斷被克隆出來,為此,本文在克隆得到煙夜蛾Helicoverpaassulta(Guenée)18SrDNA全序列的基礎上,選取幾種已知18SrDNA全序列的蛾類昆蟲,通過構建全序列和不同序列片段的系統(tǒng)發(fā)育樹,分析了利用18SrDNA構建發(fā)育樹的最適片段和方法,探討了在低級分類階元中應用的可能性,期望為蛾類昆蟲分子系統(tǒng)學研究提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗昆蟲煙夜蛾采自河南農業(yè)大學科教園區(qū)煙田,在室內用人工飼料飼養(yǎng),光照條件16L∶8D,溫度26±1℃,相對濕度75%±2%。1.1.2試劑和生化試劑基因組提取試劑盒UniversalGenomicDNAExtractionKit、DL2000Marker和rTaq酶購自TaKaRa公司,DNA凝膠回收試劑盒購自天為時代公司,其他生化試劑均為國產分析純試劑。1.2方法1.2.1dna提取基因組提取按TaKaRa公司生產的UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0方法提取。1.2.2dna的合成參考GenBank上已登錄的棉鈴蟲和家蠶的18SrDNA基因序列,用Primer5.0設計特異性引物,覆蓋蛾類昆蟲的18SrDNA全部序列,序列如下:18SP1:5′-TCCCTGGTTGATCCTGCCAGTAG-3′(正向引物)18SP2:5′-GCAAATGCTTTCGCTGATGTTC-3′(反向引物)18SP3:5′-TAATGATCCTTCCGCAGGTTC-3′(反向引物)18SP4:5′-GCCTGAGAAACGGCTACCACATC-3′(正向引物)以上引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.2.3rtaq0.2orta2o反應PCR反應過程如下:以50ng煙夜蛾基因組DNA為模板,10×Buffer2.5μL,dNTP2μL,正向引物和反向引物各為2μL,rTaq0.2μL,補充ddH2O至總體積25μL,反應在SENSOQUESTLABCYCLER公司生產的PCR擴增儀上進行。反應程序為:94℃1min,56℃1min,72℃2min,35個循環(huán),最后延伸10min(用18SP1和18SP2引物對、18SP3和18SP4引物對時延伸時間1.5min,用18SP1和18SP3引物對時延伸時間2min),4℃保存。1.2.4回復突變體的構建PCR反應結束后,經瓊脂糖電泳檢測后,在紫光燈下切下目的條帶,使用天為時代公司生產的DNA片段凝膠回收試劑盒純化產物。將回收產物與TaKaRa公司生產的PMD-19載體進行連接(回收產物3μL、PMD-19載體1μL、Solution1.5μL,ddH2O補齊10μL),之后將連接產物轉化入JM109感受態(tài)細胞中,在含有LB(Amp80μg/mL,IPTG40μg/mL,X-gal40μg/mL)固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h,進行藍白斑篩選,隨機挑選陽性重組子,擴大培養(yǎng)并提取質粒DNA,質粒DNA用PCR檢測,選取正確的克隆送TaKaRa公司測序。1.3序列分析2結果與分析2.1ssr-pcr擴增以煙夜蛾基因組DNA為模板,利用18SP1和18SP2、18SP3和18SP4、18SP1和18SP3共3對引物進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)。從圖1可以看出,產物大小分別為1kb、1.5kb和1.9kb左右,與預期大小一致,分別命名為Hass18SrDNA-1、Hass18SrDNA-2和Hass18SrDNA。將純化的擴增片段與PMD-19載體連接,轉化大腸桿菌JM109,無菌條件下均勻涂于含有Amp、X-gal、IPTG的LB平板上,37℃培養(yǎng)箱內過夜培養(yǎng)。挑選白斑轉入含有Amp的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),用PCR方法鑒定出陽性克隆并進行測序。序列測定結果表明,利用引物對18SP1和18SP2、18SP3和18SP4、18SP1和18SP3進行擴增,分別得到了1021bp、1492bp和1904bp的序列。其中Hass18SrDNA-1和Hass18SrDNA-2序列有609bp的重疊(圖2),進行序列拼接后與HassHass18SrDNA與已登錄的其他蛾類昆蟲的18SrDNA具有較高的一致性,因此,該基因為煙夜蛾18SrDNA的全長序列(已在GenBank中登記,登錄號為EU057177)。2.2煙夜蛛同源性和缺失區(qū)的組成及序列比對用GeneDoc軟件分析8種蛾類18SrDNA全序列的同源性,用MEGA4.0軟件計算這些基因兩兩間的遺傳距離,結果見表2?？梢钥闯?已報道8種蛾類18SrDNA全序列的同源性達92%以上,遺傳距離介于0.003～0.037之間。其中同科蛾類間的同源性相對較高,遺傳距離較近,如夜蛾科的煙夜蛾和棉鈴蟲的同源性達到99%,遺傳距離僅0.003;天蠶蛾科的柞蠶和蓖麻蠶的同源性為95%,鹿紋天蠶蛾則例外,與兩種夜蛾的遺傳距離更近。利用GeneDoc軟件對8種蛾類的18SrDNA進行多序列比對,根據(jù)結果得出煙夜蛾的同源區(qū)和多變區(qū)分布圖(圖3)?？梢钥闯?煙夜蛾與其他蛾類共有4段同源區(qū),而多變區(qū)則分布在序列的中部。在這些蛾類18SrDNA全序列中最保守的兩段序列Part1長度為352bp,Part2為長度503bp,分別相當于煙夜蛾18SrDNA的第306bp至653bp和第922bp至1424bp區(qū)域。兩段序列中的多變區(qū)長度為269bp,相當于煙夜蛾18SrDNA基因的第654bp至921bp區(qū)域。2.3家蠶、斑蛛、鹿紋天蠶類型的聚合分析利用MEGA4.0軟件,采用鄰位連接法(NJ)和最大簡約法(MP);利用Phylip3.67軟件,采用最大似然法(ML)(經全局重排,自展重復數(shù)為1000)分別構建8種蛾類18SrDNA全序列、保守區(qū)Part1+Part2序列和保守區(qū)Part1與Part2間多變區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,得到圖4～6。從圖4可以看出,在用NJ法構建的18SrDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹中,煙夜蛾與棉鈴蟲首先聚在一起,其次與鹿紋天蠶蛾共聚一支;家蠶與斑蛾聚在一支上,并與大蠟螟共聚一支,這兩支共同聚集在一支上,天蠶蛾科中的3種蛾類距離較遠,與傳統(tǒng)分類不相符合。在用MP法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,棉鈴蟲與煙夜蛾共聚一支,柞蠶與蓖麻蠶聚在一支,兩者共聚后與鹿紋天蠶蛾聚在一起,接著分別與蠟螟、家蠶和斑蛾共聚,與傳統(tǒng)分類比較符合。在用ML法構建的發(fā)育樹中,家蠶和斑蛾聚在一起,然后與蠟螟共聚一支;柞蠶與蓖麻蠶聚在一支,然后與家蠶一支共聚,棉鈴蟲與煙夜蛾共聚一支,而鹿紋天蠶蛾獨自一支,此結果與用MP法構建的發(fā)育樹結果接近,不同的是ML法中,鹿紋天蠶蛾獨立存在,與天蠶蛾科的距離較遠,更接近于夜蛾科的兩種昆蟲。從圖5可以看出,在用NJ法構建的保守區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹中,煙夜蛾與柞蠶聚在一起,棉鈴蟲與家蠶聚在一起,然后共聚在一支上,而鹿紋天蠶蛾、蓖麻蠶與蠟螟共聚一起,天蠶蛾科中3種蛾類相距較遠,夜蛾科兩種昆蟲也未聚在一起,與傳統(tǒng)分類明顯不符。在用MP法和ML法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,棉鈴蟲與斑蛾首先聚在一起,其他與NJ法結果相近,也與傳統(tǒng)分類明顯不符。從圖6可以看出,用NJ法和MP法構建的多變區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹結果相似,煙夜蛾與棉鈴蟲共同聚在一支上,天蠶蛾科中的柞蠶與蓖麻蠶聚在一支,蠟螟、家蠶和斑蛾共聚在另一支上,而鹿紋天蠶蛾卻聚在了夜蛾科的一支上,與傳統(tǒng)分類比較符合。而用ML法構建的發(fā)育樹卻顯示了不同的結果,煙夜蛾與鹿紋天蠶蛾首先相聚,然后與棉鈴蟲聚在一支;蠟螟、家蠶與鹿紋天蠶蛾共聚一支;柞蠶與蓖麻蠶分別位于不同的分支,與傳統(tǒng)分類差異較大。3形態(tài)分類方法在18srdna全序列系統(tǒng)發(fā)育樹的應用真核生物18SrDNA全序列長度一般為1800bp左右,本研究的8種蛾類18SrDNA序列全長為1849～1907bp,基本在這一范圍之內。根據(jù)MEGA4.1軟件的統(tǒng)計,8種蛾類18SrDNA全序列中堿基A、T、C和G的平均含量分別為25.3%、25.5%、22.3%和26.9%,表明堿基組成基本上無偏異。因此,可以認為本研究構建的系統(tǒng)發(fā)育樹沒有受到堿基組成偏異的影響或影響甚微。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展,依據(jù)核酸、蛋白質序列信息研究分子進化(molecularevolution)成為生命科學中最引人注目的領域之一。其中在昆蟲分子系統(tǒng)學研究方面,目前多通過選擇合適的基因序列,利用鄰接法(NJ)、最大簡約法(MP)和最大似然法(ML)構建系統(tǒng)發(fā)育樹來分析物種的進化(許麗等,2007;王偉芹和劉志琦,2007),至于這3種方法的優(yōu)劣尚無公論(NeiandKumar,2000)。一般認為,若有合適模型使用ML法效果較好;近緣序列一般使用MP法;而遠緣序列一般使用NJ法或ML法。本研究采用最大簡約法(MP)構建的蛾類18SrDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹或基于保守區(qū)Part1與Part2間的多變區(qū)序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹與傳統(tǒng)分類系統(tǒng)比較接近,唯一例外的是天蠶蛾科的3個種,同源性分析與遺傳距離分析同樣支持這一結果。一般認為柞蠶和蓖麻蠶屬于Saturniinae亞科,而鹿紋天蠶蛾屬于Hemileucinae亞科,但也有認為Hemileucinae亞科不應歸屬于天蠶蛾科,而應獨立為Hemileucidae科,本研究結果支持后一種觀點。通過分析蛾類昆蟲的系統(tǒng)分化可以發(fā)現(xiàn),斑蛾科分化較早,然后蠶蛾科和蠟螟科分別分化出來,天蠶蛾科介于蠶蛾科與夜蛾科之間。雖然許多人認為最大似然法(ML)在原理上優(yōu)于前兩種方法,是最接近進化關系的算法,但從本文的結果來看,ML法始終未能顯示出與傳統(tǒng)分類結果相似的特征,僅在該基因的全長序列分析中顯示了接近的結果。上述結果已經表明,三種方法相比,在構建蛾類18SrDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹時,采用MP法的構建結果更加符合形態(tài)分類系統(tǒng);ML法則顯示出與MP法較為近似的結果;在構建多變區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹時,用NJ法和MP法結果差異不大。因此,對于分類地位不明確的蛾類,可以克隆其18SrDNA基因全序列或多變區(qū)基因序列進行分析。近年來,利用18SrDNA基因進行科以下分類階元的研究逐漸受到關注。Marvaldi等(2002)將18SrDNA序列數(shù)據(jù)和形態(tài)數(shù)據(jù)相結合,研究了鞘翅目象甲總科各科之間的系統(tǒng)發(fā)育,得到的樹的拓撲結構很好地解決了各科的單系性和他們之間的關系;Ribera等(2002)用18SrDNA證明了鞘翅目肉食亞目水生肉食類的單系性;Ohnishi等(2003)研究了膜翅目蟻科7個亞科的系統(tǒng)發(fā)育關系;Sha等(2006)研究了姬