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ICS67.080.01CCSB31
6528巴音郭楞蒙古自治州地方標(biāo)準(zhǔn)DB6528/T189—2023加工辣椒品種InDel指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建規(guī)范ProcessingpeppervarietiesInDelfingerprintdatabaseconstructionspecification.20232023080120230815巴音郭楞蒙古自治州市場(chǎng)監(jiān)督管理局??發(fā)布DB6528/T189DB6528/T189—2023DB6528/T189DB6528/T189—2023目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語(yǔ)和定義 1InDel標(biāo)記鑒定程序 2標(biāo)記類型及標(biāo)記來(lái)源 2檢測(cè)方法 2質(zhì)量保證 2DNA質(zhì)量 2引物序列 2酶及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑 3PCR擴(kuò)增反應(yīng) 3樣品的來(lái)源及性質(zhì) 3品種來(lái)源 3樣品類型 3樣品分析數(shù)量 3引物及流程的評(píng)估 3評(píng)估用的品種數(shù)量及名單的確定 3引物評(píng)估的取舍 4不同來(lái)源數(shù)據(jù)的有效整合 4固定一套核心引物 4提供標(biāo)準(zhǔn)品的要求 4提供標(biāo)準(zhǔn)DNA的要求 4確定引物等位基因BIN的要求 4異常帶型的數(shù)據(jù)處理方式 4數(shù)據(jù)的編碼方式 4構(gòu)建品種DNA指紋模式庫(kù) 5構(gòu)建品種DNA指紋擴(kuò)展庫(kù) 5數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的隨機(jī)盲測(cè) 5I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件主要起草人:張建文、張國(guó)儒、楊生保、唐亞萍、楊濤、李輝玲、帕提古麗·艾斯穆托拉、火順利、董潔、葉遠(yuǎn)榮。本文件實(shí)施應(yīng)用中的疑問(wèn),請(qǐng)咨詢新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。(新疆庫(kù)爾勒市石化大道64號(hào)小區(qū)(新疆庫(kù)爾勒市英下路巴州農(nóng)科院新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院聯(lián)系電話郵編:841000新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所聯(lián)系電話郵編:830091新疆巴音郭楞蒙古自治州市場(chǎng)監(jiān)督管理局聯(lián)系電話郵編:841000IIII加工辣椒品種InDel指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建規(guī)范范圍本文件規(guī)定了加工辣椒品種InDelDNADNA本文件適用于加工辣椒品種鑒定及DNA指紋庫(kù)的建立。規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。InDel標(biāo)記Insertion-deletion根據(jù)基因組中插入缺失位點(diǎn),設(shè)計(jì)一些擴(kuò)增這些插入缺失位點(diǎn)的PCR引物,這就InDel標(biāo)記。DNA指紋DNAfingerprint具有完全個(gè)體特異的DNADNAPAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。注:根據(jù)寡核苷酸的大小來(lái)分離,因此可將全長(zhǎng)產(chǎn)物與不完整的短分子分開,適合變性蛋白的處理。引物primer是一小段單鏈DNA或RNA,作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn),在核酸合成反應(yīng)時(shí),作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈,在引物的3’-0H上,核苷酸以一酯鏈形式進(jìn)行合成,因此引物的3’-0H,必須是游離的。核心引物coreprimers指多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特性好、可作為DNA指紋鑒定優(yōu)先選用的一套引物。注:定性狀進(jìn)行調(diào)整。標(biāo)準(zhǔn)品種standardvariety1DNA指紋庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中作為譜帶分型的參照標(biāo)準(zhǔn),并輔助判斷試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性。注:以一套典型的遺傳基礎(chǔ)廣泛的高度純合自交系為試材,對(duì)擬建庫(kù)的引物進(jìn)行DNA指紋分析,就可確定代表每個(gè)引物不同譜帶的標(biāo)準(zhǔn)品種名單。DNAstandardDNA由一個(gè)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一按規(guī)定的DNA提取方法一次性提取足量的標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA,經(jīng)DNA指紋分析驗(yàn)證其真實(shí)的指紋帶型后統(tǒng)一發(fā)放。InDel通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行PCR(或聚丙烯酰胺凝膠電泳)和放射自顯影(或銀染),可檢測(cè)到在簡(jiǎn)單重復(fù)序列重復(fù)單位數(shù)不同的DNA區(qū)域的多態(tài)性。標(biāo)記類型及標(biāo)記來(lái)源采用InDel標(biāo)記作為加工辣椒DNA指紋庫(kù)構(gòu)建的標(biāo)記方法。檢測(cè)方法7質(zhì)量保證DNA質(zhì)量純度要求:OD260/OD280在1.8~2.0之間。7質(zhì)量保證DNA質(zhì)量純度要求:OD260/OD280在1.8~2.0之間。引物序列表1 17對(duì)引物序列表2引物編號(hào)標(biāo)記名稱上游引物下游引物InDel16CIDH119AGGAACTAAAAAGTGGTTTTGGGTTCACACACGTCCAACCCAATInDel33CIDH108ACAATCGAAGGGGAGCCTTGTCCTCTGTTTCATGATTCCGACTInDel41CIDH116AGGAGAAAAAGAAAGAACAACCACACGAAGCCCTTCACATTAACGTInDel63CIDH110ACTCTTGGAAGATGGGGTTCACCGAAGTAAAATAGGAAAATTGCCAInDel88CIDH107AGCCCAATAGAAAGATTGCTCACGCTGAATTTTGAAATATTTAGTCTGGInDel137CIDH128ACAAGGAGAAAAGGGGCCTTCTGTATCTCGGCTTAAAGGGGTInDel146CIDH109GGAACCCGACCACCAGAAAATCGCGGGGACTATTTACCCTInde1172CIDH135GGTGGGACCAAAGAGAGTTTTGAACAAGCAAAAGCCAAGA表117對(duì)引物序列表(續(xù))引物編號(hào)標(biāo)記名稱上游引物下游引物InDel200CIDH135ACTCACAGTCCTTAAACTTACAAAACTTGCCACTATAAATCCATCACCGAInDel201CIDH136AGGCACCAGTTAGCTCGAAAAGCGCATCTCAATCTATGTCGAInDel206CIDH113CCTGGAGGCTATGCACCATTATTTGCAGCCACCCAGCATAInDel209CIDH116CGCTACGAGTGGTACCTGACTGGGGATTGCTTCATTGGTGTInDel211CIDH118TCAGTTGTGTCCTGAACCCTACATGCAGAACAAATAGCCCTInDel215CIDH122ACCGTTGACACTTCCATGCTAATCCCCACGTGCAGTTCATInDel219CIDH126CCGAGCATTGAGACCGAGTTAAGCTTTCTGATCCACCCCCInDel228CIDH135TGACACGTGACATTCAGCGTTGACCTACAAACACACTGCTCAInDel234CIDH113AAAAAGGGCAGCTCGGTGTAGAACCCCCTGAAGAGAAGGCPCR對(duì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫(kù)時(shí)采用的試劑指定供貨廠家及規(guī)格。PCR統(tǒng)一采用相同的反應(yīng)程序及反應(yīng)體系。8樣品的來(lái)源及性質(zhì)8樣品的來(lái)源及性質(zhì)品種來(lái)源品種來(lái)源應(yīng)可靠,建庫(kù)品種主要來(lái)自:——新疆維吾爾自治區(qū)區(qū)域試驗(yàn)和品種審定委員會(huì)審定的品種以及品種權(quán)保護(hù)部門保護(hù)的品種;——國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù);——向育種單位直接征集。樣品類型主要包括種子或葉片??梢蕴峁┤~片等營(yíng)養(yǎng)組織或提供符合要求的DNA樣品。樣品分析數(shù)量9引物及流程的評(píng)估評(píng)估用的品種數(shù)量及名單的確定31~2套遺傳上或形態(tài)上極為相似的材料以評(píng)估引物對(duì)近似品種的區(qū)分能力。引物評(píng)估的取舍10不同來(lái)源數(shù)據(jù)的有效整合不同來(lái)源DNA指紋數(shù)據(jù)的有效整合問(wèn)題是DNA固定一套核心引物17對(duì)引物作為構(gòu)建加工辣椒DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)用的基本核心引物。提供標(biāo)準(zhǔn)品的要求標(biāo)準(zhǔn)品的要求如下:——除了少數(shù)稀有譜帶類型不易找到標(biāo)準(zhǔn)品種時(shí)選用特殊自交系外,宜盡量選用國(guó)內(nèi)外已知的常用自交系為標(biāo)準(zhǔn)品種;——標(biāo)準(zhǔn)品種應(yīng)純合;——標(biāo)準(zhǔn)品種應(yīng)容易擴(kuò)繁保種;——標(biāo)準(zhǔn)品種由指定的單位統(tǒng)一擴(kuò)繁保種,統(tǒng)一發(fā)放;——宜盡量用較少的品種代表較多種譜帶類型。提供標(biāo)準(zhǔn)提供標(biāo)準(zhǔn)DNA的要求提供標(biāo)準(zhǔn)DNA的要求如下:——DNA質(zhì)量符合要求,純度高,OD260/OD280在1.8~2.0之間;——DNA經(jīng)過(guò)指紋分析反復(fù)驗(yàn)證,證明能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出預(yù)期大小的譜帶;——同一批次提取的DNA量要大,大于或等50ug。確定引物等位基因BIN的要求確定引物等位基因BIN的要求如下:——應(yīng)包括主要的等位基因;——如果稀有等位基因也包括在內(nèi)的話,應(yīng)標(biāo)注其為突變型;——每個(gè)等位基因根據(jù)其表現(xiàn)特征,確定其擴(kuò)增片段大小的區(qū)間范圍。異常帶型的數(shù)據(jù)處理方式異常帶型主要包括:稀有帶型、零帶型、弱帶型、缺失帶型等?!獙?duì)稀有帶型應(yīng)如實(shí)記錄,但應(yīng)標(biāo)注其為稀有帶型;——對(duì)零帶型應(yīng)盡量避免,如果某引物出現(xiàn)的零帶型比率較高(>5%),則該引物應(yīng)剔除;——對(duì)弱帶型及缺失帶型應(yīng)盡可能通過(guò)重新擴(kuò)增將數(shù)據(jù)補(bǔ)齊。數(shù)據(jù)的編碼方式主要有3種:4——根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對(duì)位置,確定不同的譜帶類型,并按擴(kuò)增片段從大到小的順序編號(hào)。適用于儀器不具有直接讀取片段大小的功能的情況;——根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小,直接記錄不同譜帶片段大小。適用于儀器具有直接讀取片段大小的功能且同一多態(tài)性位點(diǎn)上采用的引物固定的情況;——將同一多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)的不同引物獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合。適用于在同一多態(tài)性位點(diǎn)同時(shí)設(shè)計(jì)并使用了多個(gè)不同引物進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的情況。數(shù)據(jù)整合采取如下兩種方案:采用記錄擴(kuò)增片段絕對(duì)大小的方式。指定某個(gè)引物為該多態(tài)性位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)引物,該位點(diǎn)設(shè)計(jì)的其它引物獲得的數(shù)據(jù)按照片段大小整體向上或向下位移的規(guī)律,統(tǒng)一轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)引物的數(shù)據(jù)。有引物的數(shù)據(jù)均以實(shí)際片段大小減去該引物擴(kuò)增的最小片段大小后記錄,因此,同一引物位點(diǎn)無(wú)論采用多少不同的引物,所獲得指紋的編碼方式是不變的,但應(yīng)提供該
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