臨床微生物學(xué)和微生物學(xué)檢驗(yàn)課件

第三章細(xì)菌感染病原性診斷疾病的種類不斷發(fā)生變遷，傳染病如鼠疫等已明顯減少，相反，由條件致病菌引起的內(nèi)源性感染卻明顯增多。同時(shí)，新的病原菌不斷出現(xiàn)，原有的病原菌因變異、耐藥等又重新流行。第三章細(xì)菌感染病原性診斷疾病的種類不斷發(fā)生變遷，傳染1目前，臨床遇到主要是條件致病菌引起的感染。正常菌群與病原菌的致病性是相對(duì)的，因此，既不要輕易認(rèn)為分離出的非致病菌是污染菌，也不要輕易認(rèn)為所發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌就是該感染的病原菌，必須結(jié)合臨床進(jìn)行進(jìn)一步的診斷。目前，臨床遇到主要是條件致病菌引起的感染。正常菌群與病2第一節(jié)臨床感染性疾病

實(shí)驗(yàn)診斷要求

一、診斷的目的1.以疾病的病原學(xué)診斷為目的,只需鑒定到細(xì)菌的種。2.為提供治療方案為目的，要進(jìn)行臨床標(biāo)本的直接藥物敏感試驗(yàn)。第一節(jié)臨床感染性疾病

實(shí)驗(yàn)診斷要33.以流行病學(xué)研究為目的,要鑒定到型。4.以了解細(xì)菌與感染的關(guān)系為目的,應(yīng)該做細(xì)致的鑒定。3.以流行病學(xué)研究為目的,要鑒定到型。4二、診斷試驗(yàn)的選擇1.選擇有鑒定價(jià)值的試驗(yàn)。2.選擇簡(jiǎn)易、快速、方便的試驗(yàn)，達(dá)到目的即可。二、診斷試驗(yàn)的選擇1.選擇有鑒定價(jià)值的試驗(yàn)。53.綜合考慮試驗(yàn)的敏感性和特異性。敏感性=陽性結(jié)果數(shù)/感染病人數(shù)，越高假陰性就越少。特異性=陰性結(jié)果數(shù)/未感染病人數(shù)，越高假陽性就越少。3.綜合考慮試驗(yàn)的敏感性和特異性。6評(píng)價(jià)某診斷試驗(yàn)的資料整理表診斷試驗(yàn)病例非病例合計(jì)陽性a(真陽性)b(假陽性)a+b陰性c(假陰性)d(真陰性)c+d合計(jì)a+cb+dN評(píng)價(jià)某診斷試驗(yàn)的資料整理表診斷試驗(yàn)病例7靈敏度與特異度靈敏度是指在患者中用該試驗(yàn)檢查得到陽性結(jié)果的百分比，它可衡量診斷試驗(yàn)正確地識(shí)別患某病的能力，亦稱真陽性率.a靈敏度(真陽性率）=x100%a+c靈敏度與特異度靈敏度是指在患者中用該試驗(yàn)檢查得到陽性結(jié)果的百8特異度特異度是指在無病者中用該試驗(yàn)檢獲得陰性結(jié)果的百分比。d特異度(真陰性率）=x100%b+d特異度特異度是指在無病者中用該試驗(yàn)檢獲得陰性結(jié)果的百分比。9靈敏度與特異度是評(píng)價(jià)一項(xiàng)診斷試驗(yàn)真實(shí)性的兩個(gè)基本指標(biāo)。從理論上講，一項(xiàng)理想的診斷試驗(yàn)其靈敏度、特異度最好均為100%，即假陽性率與假陰性率均為零，無一漏診與誤診，但事實(shí)上難以達(dá)到，通?；疾≌吲c非患病者的測(cè)定值有重疊現(xiàn)象，靈敏度升高，則特異度降低，反之成立。靈敏度與特異度是評(píng)價(jià)一項(xiàng)診斷試驗(yàn)真實(shí)性的兩個(gè)基本指標(biāo)。從理論10三、常用診斷流程1.雙歧索引用于相互區(qū)別比較有特征的細(xì)菌，如革蘭陰性桿菌初步分群；對(duì)于相互區(qū)別較難的細(xì)菌，鑒定項(xiàng)目較多,用起來不太方便。三、常用診斷流程1.雙歧索引112.表解法：將各種細(xì)菌及其多種特性列成矩陣表格，使相互的區(qū)別點(diǎn)十分明顯，便于分析比較。此法對(duì)于相互區(qū)別比較復(fù)雜的細(xì)菌，如腸桿菌科的初步分屬。書上17頁表2-12.表解法：123.數(shù)字編碼鑒定法

將所得生化反應(yīng)模式轉(zhuǎn)化成數(shù)學(xué)模式，可把細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)化成數(shù)字，經(jīng)檢索手冊(cè)又可將轉(zhuǎn)化成細(xì)菌名稱。與電腦分析軟件配套，形成了半自動(dòng)或全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)。數(shù)字編碼鑒定已有商品成套供應(yīng)，由于操作簡(jiǎn)單、鑒定方法易于掌握，被臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。3.數(shù)字編碼鑒定法將所得生化反應(yīng)模式轉(zhuǎn)化成數(shù)學(xué)模式，13組別試驗(yàn)項(xiàng)目代碼結(jié)果結(jié)果代碼總值

1硫化氫苯丙氨酸葡萄酸鹽421--+0011

2靛基質(zhì)甲基紅枸櫞酸鹽421-++0213

3尿素動(dòng)力產(chǎn)氣421+++421

74賴氨酸鳥氨酸棉子糖421++-420

6

5山梨醇側(cè)金花醇木膠糖421++-420

6組別試驗(yàn)項(xiàng)目代碼結(jié)果結(jié)果代碼總值硫化氫4-14第二節(jié)臨床標(biāo)本的采集

與處理

一、標(biāo)本采集的一般原則

1.病程早期、急性期或癥狀典型時(shí)，使用抗生素前。否則在培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入拮抗劑。2.無菌采集：標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)注意無菌操作，盡量避免雜菌污染。第二節(jié)臨床標(biāo)本的采集

與處理

一、標(biāo)本153.根據(jù)目的菌的特性用不同的方法采集適量標(biāo)本，采集量不應(yīng)過少。4.注意在不同病程采集不同部位標(biāo)本。5.采集標(biāo)本時(shí)要防止傳播和自身感染。3.根據(jù)目的菌的特性用不同的方法采集16二、標(biāo)本的處理1.標(biāo)本保存在4℃環(huán)境中，在2h之內(nèi)送檢。腦脊液則要在25℃保存，用于細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本保存時(shí)間不應(yīng)超過24h。對(duì)環(huán)境敏感的細(xì)菌應(yīng)保溫并立即送檢。二、標(biāo)本的處理1.標(biāo)本保存在4℃環(huán)境中，在2h之內(nèi)送檢。172.標(biāo)本中可能含有致病菌，必須注意安全防護(hù)。切勿污染環(huán)境。對(duì)于烈性傳染病標(biāo)本運(yùn)送時(shí)更要由專人運(yùn)送，嚴(yán)格按規(guī)定包裝。2.標(biāo)本中可能含有致病菌，必須注意安全183.厭氧性標(biāo)本應(yīng)放在專門的運(yùn)送瓶或試管內(nèi)運(yùn)送，有時(shí)可直接用抽取標(biāo)本的注射器運(yùn)送。4、標(biāo)本做好標(biāo)記，詳細(xì)填寫化驗(yàn)單，保證各環(huán)節(jié)的準(zhǔn)確無誤

3.厭氧性標(biāo)本應(yīng)放在專門的運(yùn)送瓶或試管內(nèi)運(yùn)送，有時(shí)可直接用抽19人體受致病菌感染后，其免疫系統(tǒng)被刺激后發(fā)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生特異性抗體?？贵w的量常隨感染過程而增多，表現(xiàn)為效價(jià)（滴度）的升高。因此，用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測(cè)患者體液中有無相應(yīng)特異抗體和其效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。一般采取病人的血清進(jìn)行試驗(yàn)，故稱為血清學(xué)診斷(serologicaldiagnosis)。第二節(jié)血清學(xué)診斷人體受致病菌感染后，其免疫系統(tǒng)被刺激后發(fā)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生特異20血清學(xué)診斷試驗(yàn)最好取患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本，當(dāng)后者的抗體效價(jià)比前者升高大于等于4倍時(shí)方有意義。常用方法：直接凝集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、ELISA。血清學(xué)診斷試驗(yàn)最好取患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本，當(dāng)后者的21第三節(jié)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查

一、顯微鏡

1.普通光學(xué)顯微鏡用油鏡放大1000倍，一般細(xì)菌均能清楚看到。2.暗視野顯微鏡用于檢查不染色的活細(xì)菌和螺旋體的形態(tài)及運(yùn)動(dòng)觀察。3.相差顯微鏡主要用于檢查不染色活細(xì)菌的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)。第三節(jié)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查

一、顯微鏡224.熒光顯微鏡可看到發(fā)射熒光的細(xì)菌。還應(yīng)用于免疫熒光技術(shù)中。5.電子顯微鏡有透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。前者適于觀察細(xì)菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，后者適于對(duì)細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)及附件觀察。4.熒光顯微鏡可看到發(fā)射熒光的細(xì)菌。還應(yīng)用23二、不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查

1.主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況。常用壓滴法和懸滴法?？蓪?duì)某些病原菌作出初步鑒定，如霍亂菌。2.螺旋體由于不易著色并有形態(tài)特征，故多用不染色標(biāo)本作暗視野顯微鏡檢查。二、不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查1.主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動(dòng)力24三、細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，除能清楚看到細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列方式外，還可根據(jù)染色反應(yīng)將細(xì)菌進(jìn)行分類。三、細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，除能清楚看25(一)常用染料

分為堿性和酸性兩大類。此外，還有復(fù)合染料。1．堿性染料電離后顯色離子帶正電荷，易與帶負(fù)電荷的被染物結(jié)合。由于細(xì)菌均帶負(fù)電荷，易與染料結(jié)合而著色。常用的有堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍(lán)等。(一)常用染料

分為堿性和酸性兩大類。此外，還有復(fù)合262．酸性染料電離后顯色離子帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的被染物結(jié)合。細(xì)菌都帶有負(fù)電荷故不易著色。通常用來染細(xì)胞漿，而很少用于細(xì)菌的染色。常用的酸性染料有伊紅、剛果紅等。2．酸性染料電離后顯色離子帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的被273．復(fù)合染料(中性染料)及熒光染料復(fù)合染料是堿性染料和酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料(伊紅美藍(lán))、姬姆薩染料(伊紅天青)等；熒光染料如熒光標(biāo)記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。這些染色常用于某些特殊的染色技術(shù)中。3．復(fù)合染料(中性染料)及熒光染料28（二）常用的染色方法分為兩種：?jiǎn)稳旧ê蛷?fù)染色法。在細(xì)菌感染標(biāo)本的檢查中，臨床上常用的復(fù)染色方法有革蘭染色、抗酸染色和熒光染色。（二）常用的染色方法分為兩種：?jiǎn)稳旧ê蛷?fù)染色法。291．革蘭染色最經(jīng)典、最常用的染色方法。在分離培養(yǎng)前都要進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。通過革蘭染色將所有細(xì)菌分為G+菌和G-菌兩大類，可初步識(shí)別細(xì)菌，有助于進(jìn)一步鑒定。1．革蘭染色最經(jīng)典、最常用的染色方法。在分離30結(jié)合細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)及排列方式，對(duì)病原菌可進(jìn)行鑒定，其結(jié)果為臨床早期診斷及治療提供了依據(jù)。革蘭染色可為臨床選擇用藥提供參考，幫助臨床制訂有針對(duì)性的治療方案。因?yàn)镚+菌和G-菌對(duì)抗生素敏感性不同，且致病物質(zhì)及其作用機(jī)理也不同。結(jié)合細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)及排列方式，對(duì)病31革蘭染色（1）染色液：1）結(jié)晶紫溶液：結(jié)晶紫溶于95%乙醇中，然后與草酸銨溶液混合過濾制成；2）碘液（盧戈碘液）：碘化鉀和碘熔于蒸餾水制成；3）95%乙醇；4）稀釋石炭酸復(fù)紅：取堿性復(fù)紅酒精飽和溶液10ml與5%石炭酸溶液90ml混合制成石炭酸復(fù)紅液，再將其用蒸餾水做10倍稀釋即成。革蘭染色（1）染色液：1）結(jié)晶紫溶液：結(jié)晶紫溶于95%乙醇中32革蘭染色（2）方法：1）涂片固定；2）結(jié)晶紫初染1min，小水沖洗；3）碘液媒染1min，小水沖洗；3）95%乙醇脫色30秒，小水沖洗；4）稀釋復(fù)紅復(fù)染1min；吸干后鏡檢。（3）結(jié)果：革蘭陽性菌：紫色；革蘭陰性菌：紅色；革蘭染色（2）方法：1）涂片固定；2）結(jié)晶紫初染1min，小33革蘭染色（4）原理：有以下幾種學(xué)說：1）等電點(diǎn)學(xué)說：G+的等電點(diǎn)（PH2~3）比G-的等電點(diǎn)（PH4~5）低，在同一PH條件下，G+比G-所帶電荷多，與帶正電荷的堿性染料結(jié)合力牢固，不易脫色；2）化學(xué)學(xué)說：G+含有大量核糖核酸鎂鹽，與進(jìn)入胞漿內(nèi)的結(jié)晶紫和碘牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被95%乙醇脫色；而G-含此種物質(zhì)少，故易被乙醇脫色；革蘭染色（4）原理：有以下幾種學(xué)說：1）等電點(diǎn)學(xué)說：G+的等34革蘭染色（4）原理：3）細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)學(xué)說：G+細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚并具有三維空間結(jié)構(gòu)，脂類含量低，乙醇不易透入，而且95%乙醇可使細(xì)胞壁脫水，細(xì)胞壁間隙縮小、通透性降低，阻礙結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物滲出；而G-細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較疏松，肽聚糖層薄且無三維空間結(jié)構(gòu)，含脂質(zhì)量多，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘復(fù)合物被溶出而脫色。目前認(rèn)為，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成上的差異是染色反應(yīng)不同的主要原因。革蘭染色（4）原理：3）細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)學(xué)說：G+細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較352．抗酸染色將細(xì)菌分為抗酸性和非抗酸性細(xì)菌兩大類。因?yàn)榇蠖鄶?shù)病原菌為非抗酸性，所以抗酸染色不作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。只用于結(jié)核病等檢查?？顾崛旧蔫b定結(jié)果。對(duì)疾病的診斷和治療具有重要參考價(jià)值。2．抗酸染色將細(xì)菌分為抗酸性和非抗酸性細(xì)菌兩36抗酸染色的方法是細(xì)菌著色后不被鹽酸乙醇脫色的染色方法?？顾嵝匀旧磻?yīng)細(xì)菌為抗酸細(xì)菌，分枝桿菌屬的細(xì)菌為抗酸性細(xì)菌。這些細(xì)菌一般染色方法不易著色，常采用抗酸染色。先用較高濃度的石炭酸復(fù)紅（5%）染色，加溫促使菌體著色，再加3%鹽酸乙醇脫色，最后用美藍(lán)復(fù)染，未脫色者呈紅色為抗酸性細(xì)菌，脫色經(jīng)復(fù)染呈藍(lán)色的細(xì)菌為非抗酸性細(xì)菌。抗酸染色的方法是細(xì)菌著色后不被鹽酸乙醇脫色的染色方法?？顾嵝?73．熒光染色

敏感性強(qiáng)，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細(xì)菌鑒定中有很大的實(shí)用價(jià)值。主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測(cè)。此外還有：鞭毛染色可觀察有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細(xì)菌鑒定中很重要。異染顆粒染色鏡檢異染顆粒，為臨床早期診斷提供依據(jù)（白喉?xiàng)U菌中的異染顆粒）。芽孢染色：可觀察細(xì)菌芽孢的大小、位置，從而鑒定細(xì)菌莢膜染色3．熒光染色384、負(fù)染色法是指將標(biāo)本的背景著色而細(xì)菌不著色的染色方法。4、負(fù)染色法是指將標(biāo)本的背景著色而細(xì)菌不著色的染色方法。39第四節(jié)細(xì)菌分離培養(yǎng)與接種技術(shù)

絕大多數(shù)細(xì)菌在適宜的條件下可以生長(zhǎng)，細(xì)菌感染性患者標(biāo)本只有經(jīng)過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，才可對(duì)感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷并指導(dǎo)臨床用藥。因此，細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)疾病的診斷、預(yù)防和治療具有重要的作用。第四節(jié)細(xì)菌分離培養(yǎng)與接種技術(shù)

絕大多數(shù)細(xì)菌在適宜的條件40（一）細(xì)菌室的符合條件1．細(xì)菌室必須安裝嚴(yán)密的門窗，以防室內(nèi)環(huán)境受到外界的污染。且室內(nèi)禁用風(fēng)扇，避免細(xì)菌的播散。2．細(xì)菌室必須安裝供空氣消毒的紫外線燈，置于操作臺(tái)上面lm處，每天開始工作前照射20min。對(duì)其消毒效果要定期檢查，及時(shí)更換失效的燈管。（一）細(xì)菌室的符合條件1．細(xì)菌室必須安裝嚴(yán)密的門窗，以防室413．室內(nèi)應(yīng)備有消毒劑，用于試驗(yàn)中發(fā)生菌液灑濺時(shí)的及時(shí)消毒處理。同時(shí)還應(yīng)備有供工作人員浸手用的盛有消毒劑的水盆、肥皂及自來水源等。4．室內(nèi)操作臺(tái)須每日用消毒劑擦洗，地面至少一周用消毒劑擦洗1次。3．室內(nèi)應(yīng)備有消毒劑，用于試驗(yàn)中發(fā)生425．對(duì)接收的標(biāo)本、無菌器具、用過的物品等應(yīng)明顯分開井放在指定位置。同時(shí)要對(duì)用過的物品及時(shí)進(jìn)行滅菌處理。6．細(xì)菌室應(yīng)有根據(jù)當(dāng)?shù)氐臍鉁靥攸c(diǎn)可安裝空調(diào)機(jī)，還需有消防設(shè)備。5．對(duì)接收的標(biāo)本、無菌器具、用過的物43(二)無菌實(shí)驗(yàn)室1．無菌室應(yīng)完全封閉，人員出入應(yīng)有兩道門，其間應(yīng)隔有緩沖區(qū)。2．用前應(yīng)以紫外線消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，徹底消毒。(二)無菌實(shí)驗(yàn)室1．無菌室應(yīng)完全封閉，人員出入應(yīng)443．在無菌室中一般僅限于分裝無菌的培養(yǎng)基及傳染性強(qiáng)的細(xì)菌的接種，不進(jìn)行有菌標(biāo)本的分離及其他操作。4．無菌室內(nèi)應(yīng)僅限操作人員進(jìn)人，而且進(jìn)入無菌室應(yīng)著隔離衣和專用鞋，操作時(shí)戴口罩，隨時(shí)保證室內(nèi)的無菌狀態(tài)。3．在無菌室中一般僅限于分裝無菌的455．條件有限的實(shí)驗(yàn)室，可用超凈工作臺(tái)代替無菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相應(yīng)的操作。超凈工作臺(tái)應(yīng)選擇垂直氣流通風(fēng)方式。6．無菌室應(yīng)配備空調(diào)設(shè)備，保證不因室溫而影響工作。5．條件有限的實(shí)驗(yàn)室，可用超凈工作臺(tái)46(三)基本設(shè)備和器具

用于細(xì)菌培養(yǎng)的溫箱、C02培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)設(shè)備；用于觀察細(xì)菌形態(tài)及標(biāo)本直接鏡檢的顯微鏡；用于物品滅菌的高壓蒸氣滅菌器、干烤箱；(三)基本設(shè)備和器具

用于細(xì)菌培養(yǎng)的溫箱、C02培養(yǎng)箱47用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基、診斷用血清、抗生素及菌種等的冰箱和冷藏柜；用于挑取標(biāo)本、接種等的接種器具，包括接種環(huán)和接種針；制備培養(yǎng)基時(shí)用的pH計(jì)用于接種器具滅菌的火焰燈或酒精燈；還有各種必用的平皿、試管、吸管等玻璃器皿，以及離心機(jī)、天平等。用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基、診斷用血清、抗生素48二、培養(yǎng)基

由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。適宜的培養(yǎng)基不僅可用于細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)、傳代、菌種保存，還可用于研究細(xì)菌的生理、生化特性，是對(duì)病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的手段。二、培養(yǎng)基

由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖49

(一)培養(yǎng)基的組成成分1.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):(1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖類；(5)血液；(6)無機(jī)鹽類；(7)雞蛋和動(dòng)物血清；(8)生長(zhǎng)因子：提供細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的氮源和碳源，還有生長(zhǎng)因子。2.凝固物質(zhì)制備固體培養(yǎng)基時(shí)，加入瓊脂，瓊脂是半乳糖膠，98℃以上時(shí)可溶于水，在45℃以下則凝固成凝膠狀態(tài)。明膠、卵白蛋白、血清。3.抑制劑和指示劑用于選擇、鑒定及判斷結(jié)果。(一)培養(yǎng)基的組成成分1.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):(1)蛋白胨；(2)50(二)培養(yǎng)基種類（按用途分類）

1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分，稱肉湯，用于增菌、檢驗(yàn)，是制備其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。2．營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可加入葡萄糖、血液、生長(zhǎng)因子等特殊成分，供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和須要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)。最常用的是血平板等。(二)培養(yǎng)基種類（按用途分類）

1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有生長(zhǎng)所513．鑒別培養(yǎng)基利用細(xì)菌分解能力及代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)過程中分解底物所釋放的不同產(chǎn)物，通過指示劑的反應(yīng)不同來鑒別細(xì)菌。如糖發(fā)酵培養(yǎng)基。3．鑒別培養(yǎng)基利用細(xì)菌分解能力及代524．選擇培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入抑制劑而抑制雜菌生長(zhǎng)，有助于對(duì)所選擇的細(xì)菌生長(zhǎng)。5．特殊培養(yǎng)基包括厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基等。4．選擇培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入抑制劑而53(二)培養(yǎng)基種類（按物理性狀分類）1、液體培養(yǎng)基：主要用于增菌2、半固體培養(yǎng)基：主要用于觀察細(xì)菌動(dòng)力、保存菌種等。3、固體培養(yǎng)基：主要用于細(xì)菌分離培養(yǎng)。又分為平板、斜面、高層及高層斜面(二)培養(yǎng)基種類（按物理性狀分類）1、液體培養(yǎng)基：主要用于增54(二)培養(yǎng)基種類（按組成成分分類）1、合成培養(yǎng)基：用各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基成分都是已知的。其特點(diǎn)是成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，價(jià)格較貴。用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)做有關(guān)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類、鑒定、生物學(xué)特性測(cè)定、選育菌種、遺傳分析等研究工作。2、半合成培養(yǎng)基：成分部分已知，微生物實(shí)驗(yàn)室用的大部分為此類培養(yǎng)基。如蛋白胨、牛肉膏、SS瓊脂等。3、非合成培養(yǎng)基：如牛乳培養(yǎng)基、雞蛋培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基等，均屬非合成性的培養(yǎng)基。(二)培養(yǎng)基種類（按組成成分分類）1、合成培養(yǎng)基：用各種營(yíng)養(yǎng)55(三)分離培養(yǎng)基的選擇

依據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心推薦，應(yīng)備有如下分離培養(yǎng)基：1．血平板適于各類細(xì)菌的生長(zhǎng)。2．巧克力血平板其中含有V和X因子，適于接種疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標(biāo)本。(三)分離培養(yǎng)基的選擇

依據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心推薦，應(yīng)備563．中國(guó)藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板有選擇地促進(jìn)G_菌生長(zhǎng)，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。4．麥康凱平板具中等強(qiáng)度選擇性，是非發(fā)酵菌鑒定的依據(jù)。5．SS瓊脂有較強(qiáng)的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌的分離。3．中國(guó)藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板有選擇地促進(jìn)G_菌生長(zhǎng)，是較好576．堿性瓊脂用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。7．血液增菌培養(yǎng)基用于從血液、骨髓中分離常見病原菌。8．營(yíng)養(yǎng)肉湯用于標(biāo)本及各類細(xì)菌的增菌。6．堿性瓊脂用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。58三、細(xì)菌接種與分離技術(shù)(一)平板劃線分離法

1．連續(xù)劃線分離法此法主要用于雜菌不多的標(biāo)本。2．分區(qū)劃線分離法本法適用于雜菌量較多的標(biāo)本。獲得單個(gè)菌落。三、細(xì)菌接種與分離技術(shù)(一)平板劃線分離法59(二)斜面接種法該法主要用于單個(gè)菌落的純培養(yǎng)、保存菌種或觀察細(xì)菌的某些特性。(三)液體接種法在試管內(nèi)壁與液面交接處研磨，多用于一些液體生化試驗(yàn)管的接種。(四)穿刺接種法此法主要用于半固體培養(yǎng)基、明膠及雙糖管的接種。

(二)斜面接種法60(五)傾注平板法測(cè)定牛乳、飲水和尿液等標(biāo)本細(xì)菌數(shù)時(shí)常用此方法。(六)涂布接種法常用于紙片法藥物敏感性測(cè)定，也可用于被檢標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。(五)傾注平板法61

四、細(xì)菌培養(yǎng)方法

(一)需氧培養(yǎng)法最常用的培養(yǎng)方法，適于需氧和兼性厭氧菌的培養(yǎng)。

四、細(xì)菌培養(yǎng)方法

(一)需氧培養(yǎng)法62(二)二氧化碳培養(yǎng)法常以下列方法供給C02。1．二氧化碳培養(yǎng)箱是一臺(tái)特制的培養(yǎng)箱，既能調(diào)節(jié)C02的含量，又能調(diào)節(jié)所需的溫度。此法適于大型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。(二)二氧化碳培養(yǎng)法常以下列方法供給C02。632．燭缸法將已接種好的培養(yǎng)基置干燥器內(nèi)，并放人點(diǎn)燃的蠟燭。干燥器蓋的邊緣涂亡凡士林，蓋上蓋子，燭光經(jīng)幾分鐘后自行熄滅，此時(shí)干燥器內(nèi)C02含量約占5％-10％，然后將干燥器放入35℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

2．燭缸法643．化學(xué)法按每升容積加入碳酸氫鈉0．4g和濃鹽酸0．35ml的比例，分別置于容器內(nèi)。將容器連同接種好的培養(yǎng)基都放人干燥器內(nèi)，蓋緊干燥器的蓋子，傾斜容器使?jié)恹}酸與碳酸氫鈉接觸生成CO2。(三)厭氧培養(yǎng)法：厭氧罐、厭氧手套箱3．化學(xué)法65第五節(jié)細(xì)菌產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定

一、細(xì)菌毒素的檢測(cè)

(一)內(nèi)毒素的測(cè)定主要用于診斷病人是否發(fā)生革蘭陰性細(xì)菌感染。另外，還可用于檢測(cè)注射用液和生物制品有無內(nèi)毒素污染。第五節(jié)細(xì)菌產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定一、細(xì)菌毒素的檢測(cè)661．細(xì)菌內(nèi)毒素的致熱作用常以家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，家兔正常體溫38．5℃～40℃。抽取被檢物注入家兔耳靜脈，記錄體溫變化情況，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1．細(xì)菌內(nèi)毒素的致熱作用常以家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，家兔正常體672．鱟（hou)試驗(yàn)鱟血液的有核變形細(xì)胞內(nèi)含凝固酶原及凝固蛋白原，當(dāng)內(nèi)毒素與鱟變形細(xì)胞凍融后的溶解物(鱟試劑)接觸時(shí)，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原變成凝膠狀態(tài)的凝固蛋白，利用此種反應(yīng)來檢測(cè)內(nèi)毒素。本試驗(yàn)對(duì)內(nèi)毒素具有高度特異性，靈敏度高，可檢查出0．005～0．0005μg／ml內(nèi)毒素。且操作簡(jiǎn)便，速度快，在2h內(nèi)即可得出結(jié)論。2．鱟（hou)試驗(yàn)鱟血液的有核變形細(xì)胞內(nèi)含凝固酶原及凝68(二)外毒素的測(cè)定1．體內(nèi)毒力試驗(yàn)細(xì)菌外毒素對(duì)機(jī)體的毒性作用，可被相應(yīng)抗毒素中和，若先給動(dòng)物注射抗毒素，然后再注射外毒素，則動(dòng)物不產(chǎn)生中毒癥狀。(二)外毒素的測(cè)定1．體內(nèi)毒力試驗(yàn)細(xì)菌外毒素對(duì)機(jī)體的毒性692．體外毒力試驗(yàn)外毒素抗原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。在體外以細(xì)菌外毒素的特異性免疫血清為抗體與被檢細(xì)菌外毒素(抗原)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，來檢測(cè)外毒素，從而鑒定細(xì)菌是否產(chǎn)生該種毒素。如白喉棒狀桿菌的Elek平板毒力測(cè)定。３．ELISA法如葡萄球菌腸毒素、腸產(chǎn)毒型大腸埃希菌LT及ST等的測(cè)定。2．體外毒力試驗(yàn)外毒素抗原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體70二、細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定

不同細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又各具有不同的生物化學(xué)特性，為此，可利用生物化學(xué)的方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌。二、細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定不同細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而71(一)碳水化合物的代謝試驗(yàn)1．糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)(1)原理：由于細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖類的酶，故分解糖的能力不同，終末產(chǎn)物亦不一致。有的能分解，有的僅能分解1-2種，還有的不能分解。有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，故可利用鑒別細(xì)菌。(一)碳水化合物的代謝試驗(yàn)1．糖(醇、苷)類發(fā)72(2)培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5％-1％的糖類(單糖、雙糖或多糖)、醇類(甘露醇、肌醇等)、苷類(水楊苷、菊糖等)。可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。(3)方法：將細(xì)菌接種到糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)數(shù)h小時(shí)至2w后，觀察結(jié)果。(2)培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5％-1％的糖類(單糖、雙糖73(4)結(jié)果：能分解糖產(chǎn)酸時(shí)，呈酸性反應(yīng)，若產(chǎn)氣可出現(xiàn)氣泡或培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象;若不分解，除有細(xì)菌生長(zhǎng)外，無任何變化。(5)應(yīng)用：是鑒定細(xì)菌最主要的試驗(yàn)，特別對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要。(4)結(jié)果：能分解糖產(chǎn)酸時(shí)，呈酸性反應(yīng)，若產(chǎn)氣可出現(xiàn)氣泡或培742．氧化一發(fā)酵試驗(yàn)(O／F試驗(yàn))(1)原理：細(xì)菌分解葡萄糖必須有分子氧參加的稱為氧化型；進(jìn)行無氧降解的稱為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。利用此試驗(yàn)可區(qū)分細(xì)菌的代謝類型。(2)培養(yǎng)基HL：Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基。2．氧化一發(fā)酵試驗(yàn)(O／F試驗(yàn))(1)原理：細(xì)菌分解葡萄糖必75(3)方法：將待檢菌同時(shí)穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，一支滴加無菌液體石蠟，高度不少于1cm。將培養(yǎng)基于35℃培養(yǎng)48h或更長(zhǎng)。(4)結(jié)果：兩支培養(yǎng)基均無變化為產(chǎn)堿型或小分解糖型；兩支培養(yǎng)基均產(chǎn)酸為發(fā)酵型；若不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。(5)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別型或產(chǎn)堿型。也呵用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。(3)方法：將待檢菌同時(shí)穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，一支滴加無菌763．β-半乳糖苷酶試驗(yàn)(1)原理：有的細(xì)菌可產(chǎn)生β·半乳糖苷酶，能分解鄰-硝基酚·β-D-半乳糖苷(ONPG)，而生成黃色的鄰-硝基酚，在很低濃度下也可檢出。3．β-半乳糖苷酶試驗(yàn)(1)原理：有的細(xì)菌可產(chǎn)生β·半乳糖77(2)試劑：O．75MONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸餾水中，在加入緩沖液(6．9gNaH2PO4溶于45ml蒸餾水中，用30％NaOH調(diào)控pH為7.0，再加水至50ml)5ml，置4℃冰箱中保存。(2)試劑：O．75MONPG溶液：取80mg溶于15ml78（3）方法：從克氏雙糖鐵培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無菌生理鹽水中制成菌懸液，加入甲苯并充分振搖，使酶釋放。將試管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG試劑，水浴20min~3小時(shí)觀察結(jié)果。（3）方法：從克氏雙糖鐵培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無菌生理79(4)結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)，一般在20～30min內(nèi)顯色。(5)應(yīng)用：迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。(4)結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)，一般在20～30min804．七葉苷水解試驗(yàn)(1)原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸的二價(jià)鐵離子反應(yīng)，生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基呈黑色。(2)培養(yǎng)基：七葉苷培養(yǎng)基、膽汁七葉苷培養(yǎng)基。4．七葉苷水解試驗(yàn)(1)原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖81(3)方法：將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏珵殛栃?，不變色者為陰性?5)應(yīng)用：主要用于D群鏈球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。也可用于革蘭陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。(3)方法：將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。825．甲基紅試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸等，使pH降至4．5以下，加入甲基紅試劑則呈紅色為陽性。若分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，則pH6．2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性。5．甲基紅試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一83(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-4d，于培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性；橘紅色為弱陽性；黃色為陰性。(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。84(5)應(yīng)用：主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。此外腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬等為陽性，而腸桿菌屬則為陰性。(5)應(yīng)用：主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，856．V-P試驗(yàn)

(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被氧氧化為二乙酰，進(jìn)而與胍基起作用生成紅色化合物，則為V-P試驗(yàn)陽性。(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。6．V-P試驗(yàn)

(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，脫86(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液(6％n·萘酚酒精溶液)和乙液(40％KOH溶液)，振搖。(4)結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性；如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。(5)應(yīng)用：常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧栃缘募?xì)菌，后者通常為陰性。

(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h87細(xì)菌L型的檢測(cè)一、細(xì)菌L型培養(yǎng)基：應(yīng)該是高滲、高營(yíng)養(yǎng)和低瓊脂的培養(yǎng)基。二、細(xì)菌L型的檢驗(yàn)程序及檢查方法：（一）樣本的采集：1、血液、骨髓液、胸腹水、尿液及其他穿刺液標(biāo)本，用無菌手續(xù)采取，即刻送檢2、糞便、陰道分泌物等易污染標(biāo)本，可用生理鹽水稀釋2-4倍，調(diào)勻，然后用0.45微升的濾膜過濾，取其濾液接種培養(yǎng)基。3、若標(biāo)本不能及時(shí)接種，應(yīng)加入等量200g/L蔗糖無菌溶液或高滲液體培養(yǎng)基保存。細(xì)菌L型的檢測(cè)一、細(xì)菌L型培養(yǎng)基：應(yīng)該是高滲、高營(yíng)養(yǎng)和低瓊脂88(二)分離培養(yǎng)：1、血液、骨髓、穿刺液標(biāo)本：應(yīng)先接種高滲肉湯增菌培養(yǎng)，出現(xiàn)輕微渾濁或沉淀后，再取0.1ml分別接種于L平板和血平板上。置350C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1-7天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況。2、胸腹水、腦脊液、尿液標(biāo)本：除用上述方法外，也可直接取標(biāo)本0.1ml，分別接種于L平板及血平板上，置350C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1-7天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況。3、痰、膿等標(biāo)本：直接取標(biāo)本分別接種于L平板及血平板上，置350C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1-7天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況。(二)分離培養(yǎng)：89（三）細(xì)菌L型的檢驗(yàn)程序1、采樣2、增菌3、革蘭氏染色和分離4、鑒定（三）細(xì)菌L型的檢驗(yàn)程序1、采樣90(四）檢查方法1、革蘭氏染色：多為革蘭氏陰性，形態(tài)不一的膨大桿狀菌、長(zhǎng)絲狀、圓球狀及巨球狀等，具有明顯多