面上項目標書范例

申請代碼H1606受理部門收件日期受理編號國家自然科學基金申請書()您現在不能檢查保護文檔或打印文檔，請根據下列三個環(huán)節(jié)操作：1)如果您是Word,wordXP,word或以上版本顧客，請把Word宏的安全性設為:"中"辦法:Word菜單->工具->宏->安全性->安全級,設立為"中"(如果您是Word97顧客，繼續(xù)執(zhí)行下列環(huán)節(jié))(如果您是Office顧客，點擊word左上角"安全警告"處"選項"中的"啟用此內容")2)關閉本文檔，重新打開本文檔3)點擊"啟用宏"按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了您現在不能檢查保護文檔或打印文檔，請根據下列三個環(huán)節(jié)操作：1)如果您是Word,wordXP,word或以上版本顧客，請把Word宏的安全性設為:"中"辦法:Word菜單->工具->宏->安全性->安全級,設立為"中"(如果您是Word97顧客，繼續(xù)執(zhí)行下列環(huán)節(jié))(如果您是Office顧客，點擊word左上角"安全警告"處"選項"中的"啟用此內容")2)關閉本文檔，重新打開本文檔3)點擊"啟用宏"按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了亞類闡明：附注闡明：項目名稱：Pyk2增進肝癌細胞遷移的一種新的分子機制研究：結合并磷酸化E-cadherin?申請人：電話：依靠單位：通訊地址：郵政編碼：266021單位電話：電子郵箱：申報日期：201FORMTEXT0年FORMTEXT2月FORMTEXT26日國家自然科學基金委員會

基本信息yoKWT/OQ申請人信息姓名性別男出生年月1973年4月民族漢族學位博士職稱副主任醫(yī)師每年工作時間（月）8電話電子郵箱傳真國別或地區(qū)中國個人通訊地址工作單位重要研究領域腫瘤分子生物學依靠單位信息名稱聯系人電子郵箱電話網站地址合作研究單位信息單位名稱項目基本信息項目名稱資助類別面上項目亞類闡明附注闡明申請代碼H1606:腫瘤復發(fā)與轉移H1617:消化系統腫瘤基地類別研究年限1月—12月研究屬性基礎研究申請經費35.0000萬元摘要(限400字)：FORMTEXTE-cadherin的喪失與肝癌轉移親密有關。其喪失的重要因素是由于其酪氨酸殘基被磷酸化后蛋白被降解。我們通過酵母雙雜交發(fā)現一種新的能與E-cadherin互相作用的非受體型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增強可增進肝癌細胞遷移。本課題假設Pyk2結合并磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin蛋白降解，細胞遷移性增加。本課題設計首先通過GSTpulldown、免疫共沉淀證明兩者互相作用可靠；另首先通過磷酸化實驗確證Pyk2能夠磷酸化E-cadherin；然后應用細胞遷移實驗和裸鼠成瘤實驗擬定：Pyk2通過磷酸化E-cadherin而影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉移；最后分析在人肝癌標本中兩者體現的有關性以及與轉移的關系。本課題新發(fā)現Pyk2能夠直接磷酸化E-cadherin，增進肝癌細胞遷移和腫瘤轉移，含有國際先進性。這對于肝癌侵襲轉移的復雜機制有新的理解，對于藥品研發(fā)提供新的思路。關鍵詞(用分號分開，最多5個)FORMTEXT肝癌；E-cadherin；Pyk2；腫瘤轉移經費申請表（金額單位：萬元）科目申請經費備注（計算根據與闡明）一.研究經費FORMTEXT=sum(tbl_budgetb3:b3)+sum(tbl_budgetb9:b9)+sum(tbl_budgetb12:b12)+sum(tbl_budgetb15:b16)28.7528.7500FORMTEXT1.科研業(yè)務費FORMTEXT=sum(tbl_budgetb4:b8)7.67.6000FORMTEXT（1）測試/計算/分析費FORMTEXT2.1000FORMTEXTDNA測序，生物信息分析，統計分析（2）能源/動力費FORMTEXTFORMTEXT1FORMTEXT（3）會議費/差旅費FORMTEXT1.0000FORMTEXT參加學術會議3-4人次（4）出版物/文獻/信息傳輸費FORMTEXT3.0000FORMTEXT文獻檢索，發(fā)表論文，專利申請（5）其它FORMTEXT1.5000FORMTEXT成果鑒定2.實驗材料費FORMTEXT=sum(tbl_budgetb10:b11)21.1521.1500FORMTEXT（1）原材料/試劑/藥品購置費FORMTEXT17.1500FORMTEXT多個試劑盒，脂質體，抗體，細胞培養(yǎng)，實驗耗材（2）其它FORMTEXT4.0000FORMTEXT動物喂養(yǎng)，臨床調研3.儀器設備費FORMTEXT=sum(tbl_budgetb13:b14)00.0000FORMTEXT（1）購置FORMTEXTFORMTEXT（2）試制FORMTEXTFORMTEXT4.實驗室改裝費FORMTEXTFORMTEXT5.協作費FORMTEXTFORMTEXT二.國際合作與交流費FORMTEXT=sum(tbl_budgetb18:b19)1.51.5000FORMTEXT1.項目構組員出國合作交流FORMTEXTFORMTEXT2.境外專家來華合作交流FORMTEXT1.5000FORMTEXT邀請美國康奈爾大學關軍林專家合作交流三.勞務費FORMTEXT3.0000FORMTEXT碩士加班補貼四.管理費FORMTEXT1.7500FORMTEXT5%管理費合計FORMTEXT=sum(tbl_budgetb2:b2)+sum(tbl_budgetb17:b17)+sum(tbl_budgetb20:b21)3535.0000FORMTEXT與本項目有關的

其它經費來源國家其它計劃資助經費FORMTEXT其它經費資助（含部門匹配）FORMTEXT其它經費來源累計FORMTEXT=sum(tbl_budgetc23:c24)00.0000 報告正文一、立項根據與研究內容：（一）項目的立項根據原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國的肝癌發(fā)病數占全球全部肝癌病例的二分之一左右，因此我國對于肝癌的研究顯得非常迫切[1]。肝癌非常容易轉移，其復發(fā)轉移是治療失敗的重要因素。理解肝癌侵襲轉移的有關機制，對于設計合理的治療藥品，進一步提高我國肝癌的治療水平含有重要意義[2]。E-cadherin在肝癌細胞的侵襲、轉移中起到了不可無視的作用。E-cadherin屬于鈣粘附蛋白家族(Cadherin家族)，在調節(jié)細胞與細胞之間、細胞與基質之間的粘附反映，介導細胞間的接觸克制和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。E-cadherin與β-catenin、p120等形成復合體發(fā)揮上述功效[3]。E-cadherin與多個腫瘤的浸潤轉移親密有關[4-5]。有人認為提高E-cadherin的體現能夠成為腫瘤治療的一種方向[6]。與其它腫瘤類似，研究表明E-cadherin在肝細胞癌的陽性率明顯低于癌旁組織及正常肝組織，體現越低則腫瘤病理分級越差，也越容易出現轉移[7-9]。有人報道缺少E-cadherin體現的人肝癌細胞株非常容易發(fā)生轉移，但是轉染E-cadherin后這種特性發(fā)生逆轉，闡明E-cadherin在肝癌細胞轉移過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。E-cadherin喪失或低體現的機制至今仍然不是完全清晰?，F在認為可能是由于基因突變造成功效喪失、啟動子甲基化后轉錄沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亞洲人群中基因突變和啟動子甲基化都不常見[12-13]。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文獻證明，酪氨酸殘基磷酸化的E-cadherin能夠與Hakai（一種E3泛素連接酶）結合，使其泛素化而降解[14]。那么有多少酪氨酸激酶參加這個機制呢？有報道EGFR，IGF-1R能夠磷酸化E-cadherin。對于E-cadherin磷酸化的調節(jié)機制現在仍然不是非常明確。為理解E-cadherin在肝癌細胞的分子信號通路，我們以E-cadherin（胞內段）為誘餌應用酵母雙雜交（CytoTRAP系統）在肝臟的cDNA文庫中篩選到一種新的能與E-cadherin互相作用的非受體型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2與否能磷酸化E-cadherin并調節(jié)細胞遷移呢？Pyk2(prolinerichtyrosinekinase2)是一種富含脯氨酸的非受體型酪氨酸蛋白激酶，與FAK同源度較高，屬于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在調節(jié)細胞存活、增殖和遷移[16]方面受到越來越多的關注。Pyk2信號通路的活化能夠增強細胞運動和遷移，研究發(fā)現Pyk2在多個腫瘤的侵襲和轉移中起作用[17-18]。其中Sun等研究表明，Pyk2在59%的肝癌組織中體現上調，Pyk2高體現與肝癌組織體積、Edmonson分級呈正有關，Pyk2體現越高病人預后越差。動物實驗顯示在侵襲邊沿的肝癌細胞和轉移到肺結節(jié)中的肝癌細胞均發(fā)現Pyk2高體現。肝癌細胞株轉染Pyk2后，其遷移功效增強；而用裸鼠做實驗發(fā)現克制Pyk2的活性后肝癌腫瘤的大小和肺轉移率都較對照明顯減少[19-20]。Pyk2調節(jié)腫瘤轉移的具體機制是什么呢？有研究表明，在肝癌細胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，與c-Src形成復合體激活ERK通路，從而增強肝癌細胞的侵襲性[19-20]；也有報道Pyk2與PECAM-1（血小板/內皮細胞粘附分子，與E-cadherin同樣都屬于鈣粘附蛋白家族）結合并且都影響腫瘤細胞的侵襲性[21]；尚有報道RhoC通過激活Pyk2增進前列腺癌轉移[18]以及與SOCS3、Cyr61有關等[22-23]?？偠灾?，現在Pyk2調節(jié)腫瘤細胞轉移的具體機制仍不十分清晰。Pyk2與E-cadherin能否結合并調節(jié)肝癌細胞的侵襲轉移呢？這是我們想要研究的問題。我們繼續(xù)應用酵母雙雜交重復驗證、GST-Pulldown實驗、免疫共沉淀證明兩者互相作用是可靠的（具體成果見研究基礎）。那么，現在的問題是兩者在體內狀態(tài)下與否結合？結合后的調節(jié)機制是什么？兩者的結合位點在什么地方？結合后如何調節(jié)細胞遷移以及影響腫瘤轉移？考慮到Pyk2是一種激酶蛋白，我們的前期工作發(fā)現E-cadherin與Pyk2的激酶部分結合，因此有兩種可能性。一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種就是E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性。我們認為第一種可能性較大。有文獻報道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族組員）并且克制其與Catenin，P120等形成復合體[24-25]。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應當也有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測，由于腫瘤始動因素的作用，Pyk2體現增多，活性增強，從而磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin降解，最后使細胞遷移性增強。但是也不能排除第二種可能性，E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性，從而造成腫瘤細胞侵襲性下降。申請人以前的工作就發(fā)現鈣粘附蛋白家族的另外一種組員γ-Protocadherins能夠克制Pyk2的活性[26]，申請人做這方面工作時曾取E-cadherin做對比參考，成果發(fā)現克制Pyk2激酶活性不是很明顯（本數據未發(fā)表），因此不支持第二種可能性。兩者具體如何調節(jié)還需要進一步實驗來證明。本課題的設計重要是為理解答上述問題。首先在前期工作基礎上繼續(xù)明確Pyk2與E-cadherin能互相作用以及調節(jié)機制；另首先應用細胞遷移實驗擬定兩者的調節(jié)對腫瘤細胞遷移、侵襲性的影響；然后應用裸鼠成瘤轉移實驗明確兩者的調節(jié)在對肝癌遠處轉移的影響；最后分析在肝癌病人組織標本中兩者體現的有關性以及與轉移的有關性。本課題在國際上最新發(fā)現Pyk2與E-cadherin直接互相作用，并且擬定其結合機制，明確這種調節(jié)與肝癌細胞遷移力和腫瘤轉移的關系。這對于肝癌侵襲轉移的復雜機制有新的理解。許多新型抗癌藥品如赫賽汀、格列衛(wèi)、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶為治療靶點，獲得非常好的療效。本研究對于擬定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做為分子治療靶點、設計合理的治療藥品能夠提供更有利的素材。參考文獻：[1]HeJ,GuD,WuX,etal.MajorcausesofdeathamongmenandwomeninChina.NEnglJMed;353:1124–34.[2]吳孟超，廖美琳，陸嘉德常見惡性腫瘤治療進展上?？萍冀逃霭嫔鏪3]BryantDM,StowJL.TheinsandoutsofE-cadherintrafficking.TrendsCellBiol.Aug;14(8):427-34[4]WellsA,YatesC,ShepardCR.E-cadherinasanindicatorofmesenchymaltoepithelialrevertingtransitionsduringthemetastaticseedingofdisseminatedcarcinomas.ClinExpMetastasis.;25(6):621-8.EpubJul4[5]SalonC,LantuejoulS,EyminB,etal.TheE-cadherin-beta-catenincomplexanditsimplicationinlungcancerprogressionandprognosis.FutureOncol.Oct;1(5):649-60[6]HowardEW,CammKD,WongYC,etal.E-cadherinupregulationasatherapeuticgoalincancertreatment.MiniRevMedChem.May;8(5):496-518.[7]GuoC,LiuQG,YangW,etal.Relationamongp130Cas,E-cadherinandbeta-cateninexpression,clinicopathologicsignificanceandprognosisinhumanhepatocellularcarcinoma.HepatobiliaryPancreatDisInt.Oct;7(5):490-6.[8]ZhaiB,YanHX,LiuSQ,etal.ReducedexpressionofE-cadherin/catenincomplexinhepatocellularcarcinomas.WorldJGastroenterol.Oct7;14(37):5665-73.[9]FransveaE,AngelottiU,AntonaciS,etal.Blockingtransforminggrowthfactor-betaup-regulatesE-cadherinandreducesmigrationandinvasionofhepatocellularcarcinomacells.Hepatology.May;47(5):1557-66.[10]OsadaT,SakamotoM,InoY,etal.E-cadherinisinvolvedintheintrahepaticmetastasisofhepatocellularcarcinoma.Hepatology.1996Dec;24(6):1460-7[11]AuerkariEI.Methylationoftumorsuppressorgenesp16(INK4a),p27(Kip1)andE-cadherinincarcinogenesis.OralOncol.Jan;42(1):5-13.[12]WeiY,VanNhieuJT,PrigentS,etal.AlteredexpressionofE-cadherininhepatocellularcarcinoma:Correlationswithgeneticalterations,β-cateninexpression,andclinicalfeaturesHepatology

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（二）項目的研究內容、研究目的,以及擬解決的核心科學問題。１.重要研究內容1）擬定E-cadherin與Pyk2體外、體內互相作用、作用位點以及調節(jié)關系。A．取E-cadherin與Pyk2不同構造域和不同突變體，應用酵母雙雜交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的辦法擬定兩者互相作用的構造域，以及作用位點。B.選用兩者體現量都適中的肝癌組織，行內源性免疫共沉淀，證明在體內兩者也互相作用。C.應用免疫熒光技術和蔗糖密度梯度超速離心辦法分析細胞組分的辦法擬定E-cadherin與Pyk2在細胞中共定位。D.應用磷酸化實驗，擬定E-cadherin與否是Pyk2的底物，應用定點突變的辦法，擬定酪氨酸的磷酸化位點。（同時再次確證E-cadherin能否影響Pyk2激酶活性。）2）從細胞水平擬定Pyk2對E-cadherin的調節(jié)影響細胞遷移。A.篩選Pyk2穩(wěn)定體現細胞株，然后應用Transwell細胞遷移實驗觀察過體現Pyk2的細胞其遷移性、侵襲性的變化，檢測過體現Pyk2時E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的變化，擬定Pyk2對E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調節(jié)影響細胞遷移。B.取高轉移肝癌細胞株MHCC97-H、HCCLM3(購自上海中山醫(yī)院肝癌研究所)，應用RNAi技術沉默Pyk2的體現，觀察細胞遷移性、侵襲性的變化，檢測對應狀態(tài)下E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和體現水平的變化。從相反方向擬定Pyk2的體現克制后對E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調節(jié)，以及這種調節(jié)對細胞遷移的影響。3）從動物模型水平擬定Pyk2對E-cadherin的調節(jié)影響腫瘤轉移。應用Pyk2穩(wěn)定體現細胞株接種裸鼠，觀察裸鼠腫瘤肺轉移肝轉移狀況，分析Pyk2的過體現對E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調節(jié)關系，以及與腫瘤轉移的有關性。4）從肝癌病人標本中尋找Pyk2與E-cadherin磷酸化狀態(tài)的有關性，以及與腫瘤轉移的的有關性。收集肝癌標本，應用免疫組化和Western等辦法擬定Pyk2的體現水平的變化與E-cadherin磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的有關性，以及兩者與腫瘤轉移的有關性。２.研究目的1）擬定Pyk2結合E-cadherin互相作用的構造域及磷酸化位點，并闡明其調節(jié)機制。2）擬定Pyk2與E-cadherin的調節(jié)可影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉移。３.擬解決的核心科學問題E-cadherin酪氨酸殘基的磷酸化造成其被降解，增加細胞侵襲性。本課題能夠擬定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2與E-cadherin的調節(jié)與否是調節(jié)腫瘤細胞轉移的新的分子機制。（三）擬采用的研究方案及可行性分析。１.研究辦法GST-pulldown，熒光共定位，內源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速離心，磷酸化實驗，定點突變，穩(wěn)定體現細胞株的篩選，RNAi克制Pyk2體現，細胞遷移、侵襲實驗，裸鼠成瘤腫瘤轉移實驗，免疫組化，定量PCR，Western檢測等。２.核心技術闡明：1）磷酸化實驗首先應用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為陽性參考，以純化的GST-E-cadherin蛋白為底物，以GST蛋白作為陰性對照，觀察Pyk2與否能夠磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin則應用生物信息分析，定點突變，尋找磷酸化位點；如果不能磷酸化E-cadherin，則以通用底物E4Y1作為底物，加入不同量的E-cadherin觀察與否能夠影響Pyk2的激酶活性。2）細胞遷移實驗首先分別用空載體PCDNA3.1，PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc轉染肝癌細胞株（PRNK為Pyk2的C段，為Pyk2的失活突變體），用G418篩選出穩(wěn)定體現細胞株。并檢測穩(wěn)定體現細胞株Pyk2蛋白體現量的不同。然后應用穩(wěn)定體現細胞株做Transwell細胞遷移和侵襲實驗，比較細胞遷移率的變化；檢測細胞遷移率的變化與Pyk2蛋白體現量的關系。同時取對應細胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測磷酸化狀態(tài)來比較E-cadherin在轉錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化以及這些變化與腫瘤遷移的關系，與Pyk2蛋白體現量的關系。3）裸鼠成瘤腫瘤轉移實驗取上述三組穩(wěn)定體現細胞株分別接種裸鼠，待腫瘤直徑約1-1.5cm時取出腫瘤重新接種于另外一批裸鼠的肝左葉。接種5星期左右處死裸鼠，收集肝臟和肺臟，觀察肝內轉移狀況和肺轉移狀況。檢測三組腫瘤Pyk2蛋白體現量的不同以及與腫瘤轉移的關系。同時取對應腫瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測磷酸化狀態(tài)來比較E-cadherin在轉錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化，擬定這些變化與腫瘤轉移的關系，與Pyk2蛋白體現量的關系。4）蔗糖密度梯度超速離心定位和內源免疫共沉淀取肝癌腫瘤的癌旁組織，裂解離心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速離心。取離心后的不同組分樣品做Western，分別用E-cadherin抗體和Pyk2抗體作為一抗檢測。如果兩者體現最多的峰值是在同一種組分中，則提示我們兩者在細胞內是共定位的。取上述兩者的體現較多的組分，用Pyk2單抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作對照），然后用E-cadherin單抗雜交檢測E-cadherin與否能與Pyk2共沉淀下來。相反方向則是：用E-cadherin單抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作對照），然后用Pyk2單抗雜交檢測Pyk2與否能與E-cadherin共沉淀下來。３.技術路線（見下圖）定點突變，定點突變，GST-pulldown，免疫共沉淀等辦法驗證擬定互相作用的構造域以及位點熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等辦法驗證在細胞以及腫瘤組織中共定位收集肝癌病人標本和臨床資料免疫組化、Western等辦法檢測E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2體現量的有關性，以及與肝癌轉移的有關性。磷酸化實驗擬定E-cadherin與否是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點細胞遷移實驗:測Pyk2蛋白過體現和RNAi克制時與E-cadherin磷酸化水平、細胞遷移的關系。篩選穩(wěn)定體現Pyk2肝癌細胞株，檢測Pyk2蛋白體現量與E-cadherin磷酸化水平的關系。裸鼠成瘤轉移實驗:Pyk2蛋白體現量、E-cadherin磷酸化水平與腫瘤轉移的關系。匯總分析數據：揭示Pyk2磷酸化E-cadherin機制；揭示Pyk2通過磷酸化E-cadherin影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉移的機制。左側部分：取E-cadherin與Pyk2不同構造域和不同突變體，應用酵母雙雜交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的辦法擬定兩者互相作用的構造域，以及作用位點。熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等辦法驗證兩者在細胞以及腫瘤組織中共定位；磷酸化實驗擬定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點。這部分內容從生化的角度擬定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子機制。中間部分：通過細胞遷移實驗、裸鼠成瘤轉移實驗從細胞水平、動物模型擬定：Pyk2通過磷酸化E-cadherin影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉移的機制。右側部分：收集肝癌病人標本和臨床資料，通過免疫組化、Western等辦法檢測E-cadherin/Pyk2蛋白水平、磷酸化狀態(tài)，分析兩者體現量的有關性，以及與肝癌轉移的有關性。最下面部分為匯總數據，總結分析。4.可行性分析前期實驗已經從酵母雙雜交、GST-PullDown、免疫共沉淀等證明了E-cadherin與Pyk2互相作用(見研究基礎部分)，并且兩者功效上親密有關。E-cadherin作為一種細胞黏附分子在細胞黏附、細胞遷移和接觸克制方面含有作用。而Pyk2能通過多個信號途徑參加調節(jié)細胞黏附、擴散和遷移等過程。因此，兩者在功效上是有互相作用基礎的?？紤]到Pyk2是一種激酶蛋白，且前期實驗成果提示Pyk2激酶區(qū)域結合E-cadherin，因此有兩種可能，一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種是E-cadherin克制Pyk2激酶活性。我們認為第一種可能性較大。根據文獻報道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且克制其與Catenin、P120等形成復合體，從而影響細胞遷移。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應當就有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測，由于腫瘤始動因素的作用，Pyk2體現增多，活性增強，從而磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin降解，最后使細胞遷移性增強。我們上述實驗設計基本基于這個邏輯。磷酸化實驗證明Pyk2磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin蛋白減少。細胞遷移實驗和動物實驗設計邏輯是通過Pyk2過體現，檢測E-cadherin磷酸化增強，蛋白量減少，造成細胞遷移增強或者腫瘤轉移增加；RNAi克制Pyk2的體現，則出現相反的成果，E-cadherin磷酸化削弱，蛋白量增加，造成細胞侵襲性削弱和腫瘤肺轉移減少。事實與否如此，需要實驗來證明。申請人以前的工作曾發(fā)現鈣粘附蛋白家族的另外一種組員γ-Protocadherins能夠克制Pyk2的活性，因此從邏輯上講也不能完全排除第二種可能性，即E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是這樣的話，則可能的假設是：在正常細胞中，E-cadherin克制Pyk2的活性，在腫瘤條件下，由于其它因素E-cadherin減少或消失，而不能克制Pyk2活性，造成Pyk2活性增強，因而腫瘤細胞遷移性增強。如果基于這個邏輯的話，實驗設計就要變化為：磷酸化實驗時應用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為底物，觀察E-cadherin對Pyk2激酶活性與否有克制作用。然后篩選E-cadherin過體現、功效失活突變體和空載體的穩(wěn)定體現肝癌細胞株，然后行細胞遷移實驗和裸鼠成瘤實驗，觀察E-cadherin蛋白過體現或功效失活突變后與細胞遷移或者腫瘤轉移的關系，同時檢測其與Pyk2蛋白體現量及磷酸化水平有關性。但是申請人在完畢γ-Protocadherins克制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做對比參考，成果發(fā)現E-cadherin克制Pyk2激酶活性不是很明顯，因此這種可能性不大。從上面的分析來看，本課題在理論和邏輯上是可行的。2）本課題是本人前期工作的延續(xù)，本人對E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作構建的質粒體現載體等為本課題的下一步研究提供了諸多有利的條件。本課題組的組員對所需要的技術辦法都很純熟，且都有對應的工作基礎，能夠在各個方面進行協作。3）本課題所涉及的技術均為較成熟的技術，所需的設備和條件本校都含有。（四）本課題的特色與創(chuàng)新之處1.本課題通過酵母雙雜交新發(fā)現一種與E-cadherin互相作用的蛋白--非受體型酪氨酸激酶Pyk2，并證明兩者的互相作用可靠，國內外研究至今未曾見過報道，含有國際先進性和獨創(chuàng)性。（有報道兩者的體現量與腫瘤轉移的關系，但是兩者直接互相作用未見報道。）2.本課題新發(fā)現Pyk2磷酸化E-cadherin影響肝癌細胞轉移的機制，對于E-cadherin在肝癌轉移過程中的分子機制有新的理解，因此含有獨創(chuàng)性和先進性。（五）年度研究計劃及預期研究成果1.年度研究計劃.01-.12磷酸化實驗擬定兩者的調節(jié)關系，肝癌組織內源免疫共沉淀擬定互相作用可靠，同時擬定兩者結合的構造域，磷酸化位點。蔗糖密度梯度超速離心，熒光共定位等有關的實驗進一步確證兩者共定位。同時收集病例標本，收集臨床資料。純化蛋白制備抗體。.01-.12細胞遷移實驗，裸鼠成瘤腫瘤轉移實驗檢測Pyk2的體現與E-cadherin的磷酸化狀態(tài)，以及細胞遷移的關系，擬定其調節(jié)機制。同時完畢E-cadherin/Pyk2的體現以及磷酸化狀態(tài)與肝癌的分期、轉移、預后、復發(fā)等臨床指標的有關性分析。.01-.12補充實驗遺漏，整頓實驗資料，統計解決實驗數據，撰寫論文。2.預期研究成果1)擬定Pyk2能夠磷酸化E-cadherin，以及兩者互相作用的構造域以及磷酸化位點。2)擬定Pyk2通過磷酸化E-cadherin，從而影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉移。3)擬定在肝癌組織中E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2體現量的有關性，以及兩者的體現與肝癌轉移的有關性。4)在國外學術期刊上發(fā)表SCI論文2-4篇，其中影響因子不不大于5的有一篇以上。在國內核心期刊發(fā)表論文2-4篇，并在國內外學術會議交流。5)培養(yǎng)碩士2-3名。二、研究基礎與工作條件（一）研究基礎第一步：為了研究肝癌轉移的機制，首先選用E-cadherin（胞內段，下列實驗同）為誘餌在肝臟的cDNA文庫中做酵母雙雜交，尋找與E-cadherin互相作用的蛋白。我們先選用的是LACZ系統藍白斑篩選，但是由于背景高而放棄。后來選用CytoTRAP系統，背景明顯減低，測序后故意義的基因有31個。其中有4個為Pyk2片段。通過克隆Pyk2基因全長驗證，擬定兩者在酵母中的互相作用是強陽性的（圖1）。（同時驗證Pyk2的同源蛋白FAK與E-cadherin互相作用為可疑弱陽性）。圖1酵母雙雜交（CytoTRAP系統）驗證Pyk2與E-cadherin互相作用pMyr-Lamin為陰性對照，pMyr-SB為陽性對照，E-Cad為E-Cadherin縮寫，下列圖示與此相似。Psos-E-Cad為誘餌蛋白。CytoTRAP系統酵母雙雜交特點為兩個蛋白如果不互相作用在25℃時能夠生長，而在37℃則不能生長,如陰性對照pMyr-Lamin所示。兩個蛋白如果互相作用則在兩個溫度下都能生長,如陽性對照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2與陽性對攝影似。第二步：原核體現E-cadherin和His-Pyk2進行GST-Pulldown。為了驗證兩者是直接結合，我們分別細菌中體現純化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全長非常難純化，得不到純化的蛋白。我們體現純化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown實驗成果證明Pyk2的激酶部分能夠與E-cadherin直接結合（圖2）。泳道123圖2原核體現E-cadherin和His-Pyk2激酶部分進行GST-Pulldown。分別原核體現GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分別與相似量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育，重復洗三次，用his抗體Western檢測，成果顯示His-Pyk2激酶部分能夠與GST-E-cadherin結合（泳道3），而不能與GST結合（泳道2），泳道1上圖是純化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作為檢測原則。第三步：原核體現E-cadherin和細胞體現Myc-Pyk2進行GST-Pulldown。我們轉染Myc-Pyk2于SYF細胞（SYF細胞株是酪氨酸激酶c-Src,Yes,和Fyn敲除的胚鼠中的成