蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)Western Blot_第1頁
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文檔簡介

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WesternBlotting）一實(shí)驗(yàn)原理

WesternBlotting是用來檢測蛋白質(zhì)的一種技術(shù)。首先將含有待測蛋白的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行凝膠電泳分離，然后將已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)通過電泳技術(shù)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上，這一固體支持物目前常為硝酸纖維素薄膜。隨后以待測蛋白質(zhì)上抗原決定簇特異性的抗體（稱為第一抗體）為探針，與固體支持物上的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶的抗第一抗體的抗體（第二抗體）與第一抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，只有與第一抗體特異性結(jié)合的待測蛋白才能與第二抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。在有辣根過氧化物酶的底物用顯色劑存在時(shí)就會出現(xiàn)顏色反應(yīng)，結(jié)合有第一抗體、第二抗體的待測蛋白，通過顏色反應(yīng)即能顯現(xiàn)出來。一實(shí)驗(yàn)原理

電泳將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固體支持物上是通過電轉(zhuǎn)移儀器完成的。它是將固體支持物面對陽極、凝膠面對陰極，二者結(jié)合在一起，然后將外面二側(cè)用Whatman3MM濾紙結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，放入電轉(zhuǎn)移儀器上，加入電泳緩沖液，通上電源后，蛋白質(zhì)即可從凝膠上轉(zhuǎn)移到固體支持物上。一實(shí)驗(yàn)原理

其定量關(guān)系符合以下公式：Ve=Vo+KV1Ve：某一溶質(zhì)的洗脫體積Vo：層析柱的外水體積Vi：層析柱的內(nèi)水體積K：某一溶質(zhì)的分配系數(shù)1．試劑電轉(zhuǎn)移緩沖液pH8.339mM甘氨酸4.8mMTris堿0.037%SDS20%甲醇混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇，定容到1000ml.封

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