植物中DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測

植物總DNA的提取

及瓊脂糖凝膠電泳檢測制作人：劉紅梅植物基因組DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)

與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制備核酸時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核蛋白釋放出來。植物總DNA包括細胞核DNA和細胞核外DNA,前者存在于細胞核內(nèi)，后者存在于細胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體DNA(ctDNA)。背景知識核酸的存在形式DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，

RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。

核酸的理化性質(zhì)細胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸基本過程①機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞壁。

細胞破碎

SDS法SDS是有效的陰離子去垢劑,

細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價鍵。CTAB法CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA提取蛋白質(zhì)

常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。RNA常選用RNase消化，或是用LiCl來消除大分子的RNA。酚類物質(zhì)

提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。多糖提取液中加1％PVP。DNA純化（去雜質(zhì)）實驗材料

新鮮蔬菜葉片(去葉脈)試劑

2×CTAB抽提液TE緩沖液(pH=8.0)

氯仿：異戊醇(24:1)

材料與試劑①離心機②水浴鍋③研缽④微量移液器儀器用具移液器－量程的選擇1．取2g清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加1/3藥匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。2．將1mL研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，置于65℃水浴中保溫20min，其間顛倒混勻2－3次。破碎細胞3.12000r/min離心5min，取上清液700μL轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心5min。抽提去蛋白4．將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加600μL異丙醇。顛倒混勻，可見DNA絮狀沉淀。沉淀核酸5．12000r/min，離心1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。

將沉淀回溶于20μLTE緩沖液待測。操作步驟1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應(yīng)與CTAB抽提液充分混勻；2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（2－5％），盡可能選取幼嫩的材料；3）收集CTAB與核酸形成的復(fù)合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難；4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。注意事項DNA分子在高于等電點的PH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。在一定電場強度下，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。電泳原理瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2儀器和試劑儀器電泳儀電泳槽灌膠模具等Tris-硼酸（TBE）

Tris-乙酸（TAE）

Tris-磷酸（TPE）常用電泳緩沖液電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強度與DNA