nr活性抑制劑對(duì)兩個(gè)油菜品種苗期根系硝態(tài)氮吸收的影響

nr活性抑制劑對(duì)兩個(gè)油菜品種苗期根系硝態(tài)氮吸收的影響

硝氮是植物最重要的礦質(zhì)養(yǎng)分，但在自然條件下，它往往是植物生長(zhǎng)的主要因素。濃度較高的硝氮容易被植物吸收，尤其是蔬菜。大量研究證明,硝酸鹽代謝的許多產(chǎn)物與癌癥有關(guān),如鼻咽癌、食道癌、胃癌及肝癌等,此外也會(huì)導(dǎo)致嬰幼兒致畸、致癌等(Ikemoto等2002;Kelley和Duggan2003;Santamaria2006;Du等2007)。自20世紀(jì)60年代以來(lái),世界各國(guó)都在致力于蔬菜中硝酸鹽污染成因及其控制途徑的研究。油菜(BrassicanapusL.)不僅是我國(guó)的重要油料產(chǎn)物,因?yàn)槠涿缙谥仓昵o葉細(xì)嫩,又常被作為冬季和早春食用蔬菜。但經(jīng)相關(guān)學(xué)者研究,其體內(nèi)硝酸鹽含量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出了我國(guó)關(guān)于蔬菜硝酸鹽含量的標(biāo)準(zhǔn)(GB18406.1-2001)(王朝輝等2001;朱飛飛2009;都韶婷和章永松2010),長(zhǎng)期食用不利于人體健康。如何從油菜作物本身出發(fā)來(lái)探討不同油菜品種硝酸鹽積累差異的機(jī)制,篩選低硝酸鹽積累的油菜品種,是解決其體內(nèi)硝酸鹽高積累的關(guān)鍵。硝酸還原酶(NR)做為硝酸鹽還原過(guò)程的關(guān)鍵酶和限速酶,其活性高低直接反映了植物對(duì)硝態(tài)氮還原及轉(zhuǎn)化能力的強(qiáng)弱,與植物吸收和積累硝態(tài)氮的能力密切相關(guān)(Crawford1995;Vidal和Gutiérrez2008)。NR為同聚多亞基蛋白,每個(gè)亞基含有3個(gè)輔基:黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、細(xì)胞色素(Cytc)以及鉬輔因子(MoCo),每個(gè)輔基就是一個(gè)氧化還原中心(Redinbaugh和Campbell1985;Crawford1995;Heidari等2011;Anjana等2011)。鉬原子(Mo)是NR的重要組成部分,直接關(guān)系到硝酸鹽還原過(guò)程的電子轉(zhuǎn)移,而鎢原子(W)性質(zhì)與鉬原子相似,可以直接取代NR復(fù)合體中的鉬,從而起到抑制NR活性的作用(Heimer等1969;Aslam1982;Deng等1989;Quy等1991;L’vov等2002;Moura等2004;Yu等2010),故Na2WO4常被作為NR活性的抑制劑。目前大部分的學(xué)者認(rèn)為,植物硝酸鹽的還原作用首先發(fā)生在綠色葉片中,然而也有部分學(xué)者認(rèn)為根系硝酸鹽還原能力在氮素利用早期具有不可比擬的作用(Gojon等1986;Stoimenova等2003)。雖然植物根系硝酸鹽還原能力最大僅占整個(gè)植株還原能力的23%~37%(Scheurwater等2002),但目前仍還沒(méi)有被完全理解,這主要與研究根系NR的難度之大有關(guān)。此外關(guān)于根系NR與地上部各器官硝態(tài)氮含量的關(guān)系的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道,也鮮見(jiàn)從抑制根系NR活性角度出發(fā)來(lái)研究各器官NR、硝態(tài)氮含量變化以及這種變化和葉柄硝態(tài)氮高積累關(guān)系的報(bào)道。為解決這一問(wèn)題,本研究選取了前期試驗(yàn)篩選所獲得的生物量沒(méi)有顯著差異,但硝態(tài)氮積累能力不同的兩個(gè)油菜品種(‘紅油3號(hào)’和‘中雙6號(hào)’),通過(guò)添加NR抑制劑Na2WO4,抑制根系NR活性,結(jié)合根系吸收速率、各器官NR活性、硝態(tài)氮含量變化,研究根系NR活性被抑制以后對(duì)各器官硝態(tài)氮積累的影響以及探討根系NR活性與不同油菜品種葉柄硝態(tài)氮積累差異的關(guān)系,從而為降低蔬菜體內(nèi)硝酸鹽含量,提高植株氮利用效率提供理論依據(jù)。材料和方法1種子處理和幼苗的培養(yǎng)選取前期篩選所得的硝態(tài)氮含量差異顯著的兩個(gè)油菜(BrassicanapusL.)品種:‘紅油3號(hào)’和‘中雙6號(hào)’。水培營(yíng)養(yǎng)液參考完全大澤營(yíng)養(yǎng)液和Arnon營(yíng)養(yǎng)液,稍作修改。營(yíng)養(yǎng)液中養(yǎng)分含量如下:NaNO312mmol·L-1;KH2PO41mmol·L-1;K2SO42mmol·L-1;MgSO4·7H2O2mmol·L-1;CaCl24mmol·L-1;H3BO32.86mg·L-1;MnSO4·H2O1.54mg·L-1;ZnSO4·7H2O0.22mg·L-1;CuSO4·5H2O0.08mg·L-1;H2MoO40.02mg·L-1;Fe-EDTA3.0mg·L-1。油菜種子經(jīng)100mL的NaClO(1%)消毒20min后,再用100mL的蒸餾水沖洗6次。將消毒后的種子放到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,加入一定量的蒸餾水使濾紙完全濕潤(rùn),之后放到恒溫培養(yǎng)箱中,黑暗條件下于25℃下培養(yǎng)24h。待種子露白后,將其播于已準(zhǔn)備好的基質(zhì)培養(yǎng)穴盤(pán)中。待幼苗長(zhǎng)至二葉一心時(shí),洗去根系基質(zhì),再將幼苗移入裝有5.2L1/4濃度上述營(yíng)養(yǎng)液的硬質(zhì)不透明塑料盆中。每盆用海綿固定同一品種4株,每個(gè)品種培養(yǎng)16盆。之后放入植物生長(zhǎng)室內(nèi)培養(yǎng),溫度設(shè)定為25~30℃/15~20℃(白天/晚上),光照時(shí)間為10h(8:00~18:00),室內(nèi)相對(duì)濕度為60%±5%,光照強(qiáng)度為180μmol·m-2·s-1。用1/4營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)2d后,換為1/2營(yíng)養(yǎng)液,培養(yǎng)一周以后換為完全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng),之后每3d換一次營(yíng)養(yǎng)液。營(yíng)養(yǎng)液每天保持上下午各通氣1h,pH用0.1mmol·L-1的NaOH和H2SO4調(diào)在6.0~6.5之間。由于植物對(duì)水分的吸收以及蒸騰作用,需每天定時(shí)(18:00)補(bǔ)充蒸餾水以保持原營(yíng)養(yǎng)液的體積。繼續(xù)培養(yǎng)15d后,將營(yíng)養(yǎng)液更換為無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液,進(jìn)行饑餓處理,2d后取油菜幼苗用于試驗(yàn)。2測(cè)試方法2.1na2wo4對(duì)治理引導(dǎo)下下油茶根系nr活性的影響將出苗35d的油菜秧苗取出,將其根部浸入添加Na2WO4的營(yíng)養(yǎng)液中,Na2WO4處理濃度分別為:0、0.4、0.8、1.0、1.3mmol·L-1,吸收3h后測(cè)定各處理油菜根系NR活性,篩選出對(duì)油菜根系NR活性抑制最強(qiáng)的Na2WO4濃度。2.2硝態(tài)氮含量的測(cè)定每個(gè)品種各選長(zhǎng)勢(shì)一致的3株幼苗為一組,作為一個(gè)處理,每個(gè)處理重復(fù)4次。將幼苗根部浸入到1000mL添加Na2WO4(1.0mmol·L-1)的營(yíng)養(yǎng)液(實(shí)驗(yàn)組:TR)中,以不添加鎢酸鈉的營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照(對(duì)照組:CK),處理與對(duì)照溶液中均含1.0mmol·L-1NO3-。營(yíng)養(yǎng)液用分析純Ca(NO3)2、Na2WO4配制,支持電解質(zhì)為0.2mmol·L-1的CaSO4,各處理的pH值均為6.0。試驗(yàn)時(shí)將油菜幼苗根系完全浸入到1000mL的上述營(yíng)養(yǎng)液中,在溫度(25±1)℃、光照強(qiáng)度180μmol·m-2·s-1、相對(duì)濕度65%~80%條件下培養(yǎng),分別在0、0.5、1.0、2.0、3.0h吸取5mL營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行硝態(tài)氮含量的測(cè)定,每次取樣后隨即加入5mL電解質(zhì)(0.2mmol·L-1CaSO4)以補(bǔ)充溶液到起始體積。吸收結(jié)束后,取出幼苗,將每組油菜根部剪下,輕輕擦干水分,稱量每組總根重。根系吸收前后溶液中硝態(tài)氮含量用流動(dòng)分析儀測(cè)定,根據(jù)吸收前后硝態(tài)氮含量的變化量計(jì)算根單位鮮重在單位時(shí)間內(nèi)硝態(tài)氮的凈吸收率。然后把油菜按器官(葉柄、葉片、根系)分開(kāi),稱量各器官的重量,分別切碎混勻,分為2個(gè)部分:用于測(cè)定硝態(tài)氮部分的樣品放入冰箱0~4℃條件下冷藏;另一部分樣品用于測(cè)定NR活性,當(dāng)天完成測(cè)定。3硝態(tài)氮含量測(cè)定NR活性采用活體法測(cè)定(李合生2000);硝態(tài)氮含量測(cè)定采用研磨浸提法(王朝輝和李生秀1996),浸提液用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定;植株從營(yíng)養(yǎng)液中吸收的硝態(tài)氮含量由營(yíng)養(yǎng)液中起始硝態(tài)氮含量與培養(yǎng)后硝態(tài)氮含量之差計(jì)算。試驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)SAS統(tǒng)計(jì)分析,SigmaPlot作圖,方差分析采用Fisher’sLSDtest。結(jié)果1na2wo4對(duì)油茶根系nr活性的影響Na2WO4處理有效降低了兩個(gè)油菜品種根系NR活性(圖1)。當(dāng)Na2WO4濃度由0增加至1mmol·L-1時(shí),兩個(gè)油菜品種根系NR活性隨著Na2WO4濃度的增加呈逐漸下降趨勢(shì)(圖1),當(dāng)Na2WO4濃度達(dá)到1.0mmol·L-1時(shí),油菜根系NR活性幾乎接近于0mmol·L-1;Na2WO4濃度由1.0mmol·L-1增加至1.3mmol·L-1時(shí),兩個(gè)油菜品種的根系NR活性則幾乎不再發(fā)生變化。由此可見(jiàn),Na2WO4濃度為1.0mmol·L-1時(shí)可有效地抑制油菜根系NR活性。2wo4中雙6號(hào)根系nr活性的變化培養(yǎng)液中添加Na2WO4后,顯著降低了兩個(gè)油菜品種根系的NR活性,但葉片和葉柄中NR活性并未顯著下降(表1)?！t油3號(hào)’未加入Na2WO4時(shí),根系NR活性為59.53μg(NO2-)·g-1(FW)·h-1,當(dāng)加入Na2WO4后,根系NR活性降至5.15μg(NO2-)·g-1(FW)·h-1,降低了54.38μg(NO2-)·g-1(FW)·h-1;‘中雙6號(hào)’由34.40μg(NO2-)·g-1(FW)·h-1降至0.37μg(NO2-)·g-1(FW)·h-1,降低了34.03μg(NO2-)·g-1(FW)·h-1;兩個(gè)油菜品種葉片和葉柄中NR活性很低(表1),均小于0.7μg(NO2-)·g-1(FW)·h-1,且兩個(gè)油菜品種葉片和葉柄中NR活性受Na2WO4影響較小,均未產(chǎn)生顯著性差異。這說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下,兩個(gè)油菜品種根系NR活性被抑條件下,對(duì)其葉片和葉柄中NR活性并無(wú)顯著影響,而低積累品種根系起始NR活性高,受抑后降低幅度為91%,較小于高積累品種的99%。3硝態(tài)氮吸收速率根系NR活性被抑制以后,兩個(gè)油菜品種對(duì)硝態(tài)氮的吸收速率明顯下降(圖2),經(jīng)差異顯著性分析,除了在剛開(kāi)始的0.5h以及1h中的‘紅油3號(hào)’外,其余時(shí)間里,兩個(gè)品種對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組硝態(tài)氮吸收速率均達(dá)到顯著性差異。高積累品種‘中雙6號(hào)’吸收速率下降的幅度較大,可達(dá)4.03μmol·g-1(FW)·h-1,低積累品種‘紅油3號(hào)’下降最快時(shí)為2.30μmol·g-1(FW)·h-1。4不同濃度根系nr活性根系NR活性被抑制后,根系硝態(tài)氮含量顯著升高,葉柄硝態(tài)氮含量顯著下降,而葉片硝態(tài)氮含量則無(wú)顯著變化(圖3)。對(duì)照與處理相比,根系NR活性被抑制后高積累品種‘中雙6號(hào)’根系硝態(tài)氮含量提高了108%,低積累品種‘紅油3號(hào)’則提高了71%;葉柄硝態(tài)氮含量,高積累品種‘中雙6號(hào)’下降幅度較小,降低了5.5%,‘紅油3號(hào)’降幅較大,降低了11.9%;葉片硝態(tài)氮含量雖然有所升高,但處理與對(duì)照差異不顯著。不同植物根區(qū)nr活性的變化本試驗(yàn)結(jié)果表明抑制兩個(gè)油菜品種根系NR活性的最佳Na2WO4濃度為1.0mmol·L-1(圖1),這與其他研究者的研究結(jié)果并不一致,如,梁亮(2008)研究發(fā)現(xiàn)抑制小白菜根系NR活性的最佳Na2WO4濃度為0.8mmol·L-1,而司江英等(2004)研究發(fā)現(xiàn)抑制水稻根系NR活性的最佳濃度為0.15mmol·L-1,這說(shuō)明不同植物根系NR活性對(duì)硝酸還原酶抑制劑Na2WO4的響應(yīng)不同,達(dá)到最強(qiáng)抑制效果所需濃度不同。Deng等(1989)研究發(fā)現(xiàn)根系硝酸還原酶活性被抑制以后,顯著影響NR的還原能力,會(huì)造成根系硝態(tài)氮的大量積累,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果。兩個(gè)油菜品種根系加入Na2WO4以后,根系中的硝態(tài)氮含量顯著升高,而根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收能力顯著下降。從品種來(lái)看,根系NR活性被抑以后,原本根系NR活性較高的低積累品種‘紅油3號(hào)’NR活性降低了91%,吸收速率4h內(nèi)平均下降了66%,而高積累品種‘中雙6號(hào)’根系NR活性的降幅為99%,吸收速率平均下降了73%,這說(shuō)明根系NR活性不僅決定了根系的還原能力,也影響著根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收速率。根系氮素在正常的還原條件下,還原產(chǎn)物會(huì)調(diào)節(jié)整個(gè)植物體氮素狀況的信息,而這一信息又調(diào)節(jié)氮素同化產(chǎn)物的反饋抑制作用,反過(guò)來(lái)作用于根系中相關(guān)基因的表達(dá),從而影響根系對(duì)氮素的吸收(Tsujimoto等2007;Patterson等2010)。筆者認(rèn)為,較高的根系NR活性,提供了其較強(qiáng)的根系還原能力和吸收能力,而根系較高的NR活性、較低的硝態(tài)氮吸收速率以及根系NR活性被抑制以后存有的NR活性的大小可能是造成低積累油菜品種根系硝態(tài)氮積累較低以及葉柄硝態(tài)氮含量低的重要原因。此外,根系NR活性的下降引起其中硝態(tài)氮大量積累,但根系中大量積累的硝態(tài)氮并沒(méi)有促成葉柄中硝態(tài)氮含量的迅速增加,其含量反而降低(圖3),說(shuō)明根系NR活性受抑制條件下,大量積累于根系中的硝態(tài)氮并沒(méi)有被運(yùn)輸?shù)降厣喜糠?。這可能的原因是,一方面,植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收和向上運(yùn)輸硝態(tài)氮均是主動(dòng)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程,需由跨質(zhì)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度提供能量,梁亮(2008)、Hansch等(2001)發(fā)現(xiàn),NR活性被抑制以后,根系可溶性糖也會(huì)大量積累。糖類的不正常代謝,,從而影響了能量的供應(yīng),進(jìn)而制約硝態(tài)氮的運(yùn)輸;另一方面,在硝態(tài)氮為唯一氮源的狀態(tài)下,植物根系NR活性被抑制以后,硝態(tài)氮的還原無(wú)法正常進(jìn)行,根系中氮代謝下游的氨基酸無(wú)法產(chǎn)生,阻礙了下游信號(hào)的傳遞,使植株無(wú)法對(duì)氮素進(jìn)行正常的分配和轉(zhuǎn)移(Hansch等2001;Flores等2004;Krouk等2010)。但是否可以在油菜收獲前期進(jìn)行短時(shí)間的NR活性抑制處理以降低其體內(nèi)硝酸鹽含量,這還有待進(jìn)一步試驗(yàn)的驗(yàn)證和肯定,但此不失為一種新的思路。對(duì)植物生長(zhǎng)而言,細(xì)胞質(zhì)中硝態(tài)氮擔(dān)任著重要角色,故當(dāng)?shù)厣喜咳钡獣r(shí),葉柄液泡儲(chǔ)存的大量硝態(tài)氮會(huì)被調(diào)動(dòng)出來(lái)運(yùn)輸至葉片細(xì)胞質(zhì)中以補(bǔ)充被代謝掉的硝態(tài)氮,使葉片中硝態(tài)氮含量保持在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)(汪曉麗2010;Fan等2007;沈其榮等2003;Granstedt和Huffake