立體定向手術(shù)大鼠顳葉癲癇模型的建立及模型永久癲癇病理學基礎(chǔ)的觀察

立體定向手術(shù)大鼠顳葉癲癇模型的建立及模型永久癲癇病理學基礎(chǔ)的觀察

過去，海洋酸（ka）用于建立大鼠癲癇模型，主要通過系統(tǒng)給藥方法進行。國內(nèi)外偶有局部給藥制作顳葉癲癇模型用于科研者,但均未對模型本身進行全面和系統(tǒng)的研究。同時,所用海人酸的濃度和劑量等差異較大。我們通過立體定向技術(shù),對海馬局部給藥建立大鼠顳葉癲癇模型所需海人酸的濃度和劑量以及模型癲癇敏感性永久存在的病理學基礎(chǔ)等進行了較系統(tǒng)和全面的研究,報道如下。材料和方法一、海人酸飼養(yǎng)體重250g的健康成年雄性Wistar大鼠30只,由中國醫(yī)學科學院動物所提供。采取自由進食水、自然晝夜的方法飼養(yǎng)。海人酸為美國Sigma公司提供。立體定向儀為國營西北光學儀器廠生產(chǎn)。WZ-50型微量注射機由浙江醫(yī)科大學醫(yī)學實驗儀器廠生產(chǎn)。ML118型腦電圖儀為澳大利亞AD儀器公司生產(chǎn)。1720DIGITAL型LEITZ冰凍病理切片機由德國生產(chǎn)。二、方法1.海馬ca3的給藥點控制系統(tǒng)用10%水合氯醛1ml腹腔內(nèi)注射麻醉后,將大鼠固定于立體定向儀上。剪除大鼠頭頂部的毛發(fā)并用75%的酒精消毒處理。沿大鼠頭頂部正中線切開頭皮,用頭皮拉鉤將左右兩側(cè)的頭皮對稱地向兩側(cè)拉開并固定。確定海馬CA3的三維坐標:X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=-6.0mm,即海馬區(qū)給藥點。首先調(diào)整X軸和Y軸的坐標,使定位針的尖端位于三維坐標系的H點,H點的坐標為:X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=0mm。然后將位于顱骨上的H點鉆透。第二步,在微量注射器內(nèi)抽入濃度為0.4μg/μl的海人酸2.5μl。然后調(diào)整Z軸的坐標,使Z軸的坐標為-6.0mm,即向下進針達CA3中心點。第三步,調(diào)整微量注射機的注射速度,使2.5μl海人酸在10min內(nèi)緩慢勻速地注射完畢,留置3min后退出注射針。然后,全層縫合頭皮。對手術(shù)后大鼠的行為學進行觀察并攝像記錄。2.致癲側(cè)海馬結(jié)構(gòu)的測定于癲癇發(fā)作后6h隨機抓取2只癲癇鼠,首先用10%水合氯醛麻醉,然后將其固定在立體定向儀上,注射海人酸側(cè)半側(cè)開顱,利用3個導聯(lián)記錄腦電活動。其中1條電極刺入對側(cè)乳突部頭皮下,另1條電極刺入致癲側(cè)的海馬結(jié)構(gòu),第3條電極分別置于嗅球、紋狀體和大腦皮質(zhì),進行腦電的監(jiān)測和記錄。腦電圖記錄完畢后,打開胸腔暴露出心臟。用1%和4%的多聚甲醛依次通過心臟進行灌注后,斷頭完整取出腦組織,放入4%的多聚甲醛中進行固定,然后將腦組織移入30%蔗糖磷酸緩沖液中4℃過夜。在冰凍切片機上切取30μm厚的冠狀腦片,進行Nissl染色形態(tài)學檢查。然后,在模型建立后1d、3d、5d、7d及2周、3周、4周、5周、6周、7周和8周分別隨機抓取2只癲癇鼠,進行腦電圖監(jiān)測和病理學檢查。結(jié)果一、麻醉不同時間后大鼠的癲癇發(fā)展情況自海馬內(nèi)注入海人酸后到麻醉清醒的大約1h期間,大鼠基本上處于安靜的麻醉狀態(tài),偶爾出現(xiàn)身體的瞬間抖動。麻醉清醒后的大約30min內(nèi),大鼠的活動較少,有時有凝視和“濕狗樣抖動(wet-dogshakes)”。麻醉清醒30min后,大鼠的“濕狗樣抖動”和凝視逐漸頻繁,間或出現(xiàn)口的咀嚼運動。麻醉清醒近1h時,大鼠逐漸變得略微活躍,口的咀嚼運動和面部抽搐逐漸頻繁,并且有大量唾液從口腔流出,同時,大鼠的雙眼裂變大,雙眼球向外突出,逐漸出現(xiàn)幅度不斷增大的點頭運動,間或出現(xiàn)左側(cè)(注射對側(cè))前肢的抽搐和搔頭動作。麻醉清醒大約1.5h后,大鼠的前肢抽搐逐漸頻繁,前肢的抽搐由單側(cè)(注射對側(cè))抽搐很快發(fā)展到雙側(cè)抽搐,抽搐時,前肢向上抬起,身體亦抬起呈半立位,但以注射對側(cè)相對較重。麻醉清醒近2h時,大鼠在不斷重復上述表現(xiàn)的基礎(chǔ)上,由前肢劇烈抽搐,發(fā)展到身體逐漸強直,呈角弓反張,逐漸出現(xiàn)頻繁的雙后肢抽搐、后退、向后跌倒和身體旋轉(zhuǎn)跌倒,在較短的發(fā)作間期,大鼠表現(xiàn)呆板、呆滯。麻醉清醒后3h時,大鼠的發(fā)作頻率逐漸下降,發(fā)作形式主要為身體強直、雙后肢抽搐、跌倒、雙前肢抽搐、點頭、咀嚼、流涎、面部抽搐等。麻醉清醒后5h,發(fā)作頻率逐漸減少,主要發(fā)作形式為雙前肢抽搐、咀嚼、點頭、流涎等,發(fā)作間期逐漸延長,但發(fā)作間期的行為仍然呆板、呆滯。麻醉清醒7h時,約10min出現(xiàn)1次發(fā)作,主要表現(xiàn)為雙側(cè)或單側(cè)前肢抽搐、點頭、咀嚼等,發(fā)作間期,大鼠變得略微活躍。麻醉清醒8h時,約20～30min有1次發(fā)作,表現(xiàn)為單側(cè)前肢抽搐、點頭等,發(fā)作間歇期,大鼠的活動有所增多,雙眼球向外突出逐漸減輕。至麻醉清醒后約11h,大鼠的癲癇發(fā)作逐漸停止,大鼠的活動雖有增多,但仍未達到正常大鼠的狀態(tài)。24h后,大鼠的活動恢復正常。24h至2個月期間,每1周大鼠出現(xiàn)1～3次發(fā)作,主要表現(xiàn)為咀嚼、點頭、單側(cè)或雙側(cè)前肢抽搐、身體強直等。二、海馬外膠質(zhì)與海馬的膠波放電模型建立后6h,腦電記錄的情況為海馬的叢集性棘波放電,嗅球、紋狀體和大腦皮質(zhì)未記錄到棘波放電。模型建立后1d,除了海馬存在棘波放電外,紋狀體和大腦皮質(zhì)可記錄到稀少的與海馬棘波同步的棘波放電。模型建立后3d,除了海馬密集的癲癇波外,紋狀體和大腦皮質(zhì)的棘波逐漸增多,同時,在嗅球可記錄到癲癇波,這些海馬外記錄到的癲癇波與海馬的棘波具有同步性。模型建立后5d至2個月,在癲癇大鼠的海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)和嗅球均可記錄到較多的癲癇波,但是這些記錄到的癲癇波并不完全同步,模型建立的時間越長,上述區(qū)域記錄到的棘波放電的同步性就越差。三、ca3組織區(qū)域的病理變化在海人酸注射后6h、1d、3d、5d、7d時,海馬CA3區(qū)域密集的錐體細胞出現(xiàn)逐漸加重的腫脹、變性和崩解。1周后,CA3區(qū)域的錐體細胞逐漸減少,注射后4周,在CA3部位的神經(jīng)細胞幾乎完全缺失,同時,有大量的膠質(zhì)細胞增生聚集成膠質(zhì)團塊(圖1)。注射對側(cè)的相應區(qū)域亦出現(xiàn)類似的病理變化,但出現(xiàn)相對晚些,同時,亦不如注射側(cè)嚴重。海馬齒狀回的神經(jīng)細胞亦逐漸減少。模型的發(fā)作形式由海人酸制作癲癇模型可分為系統(tǒng)給藥和局部給藥兩種方法,系統(tǒng)給藥操作方便,制作簡單,被廣為利用。但系統(tǒng)給藥制作癲癇模型的不足也逐漸顯現(xiàn)出來。首先,系統(tǒng)注射海人酸,藥物通過體循環(huán)后,進入大鼠腦組織內(nèi),因此,不同種屬、不同個體和不同年齡的大鼠對海人酸的反應亦表現(xiàn)出明顯的不同。相同條件的SD大鼠對海人酸的反應就比同樣條件的Wistar大鼠對海人酸的反應遲鈍得多,老年大鼠就比年輕大鼠對相同劑量的海人酸要敏感得多。這樣就使實驗條件的處理和實驗研究的設(shè)計變得復雜。其次,由于系統(tǒng)給藥時,只有不足1%的藥物可以透過血腦屏障進入大鼠的腦組織中,與腦內(nèi)的相應受體結(jié)合,海人酸價格昂貴,不難看出其中的浪費。而利用立體定向技術(shù),海馬局部按4μg/kg體重注射海人酸,建立大鼠顳葉癲癇模型,雖然操作看似復雜,卻避免了系統(tǒng)給藥的不足。1972年,Racine提出了記錄癲癇大鼠發(fā)作時行為學改變的分級標準:I級,咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐;Ⅱ級,以點頭運動為主的頸部肌肉的抽搐;Ⅲ級,單側(cè)前肢的陣攣、抽搐;Ⅳ級,雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起;V級,雙側(cè)后肢強直、身體背曲強直、跌倒。在本實驗中,大鼠經(jīng)歷癲癇前的頻繁的“濕狗樣抖動”之后,即進入I級發(fā)作狀態(tài),很快進入Ⅱ級發(fā)作狀態(tài),同時,I級和Ⅱ級發(fā)作狀態(tài)會有交叉,之后進入Ⅲ級發(fā)作狀態(tài),很快即進入Ⅳ級發(fā)作狀態(tài),Ⅲ級和Ⅳ級發(fā)作狀態(tài)也有交叉,然后,大鼠的癲癇發(fā)作進入V級狀態(tài)。整個的點燃過程經(jīng)歷了從I級到V級的發(fā)作,點燃成功后,癲癇大鼠每周出現(xiàn)1～3次I級到Ⅳ級的不同形式的發(fā)作,具有了癲癇的長期敏感性。實際上,從發(fā)作形式上看,模型模擬了人類顳葉癲癇從“口唇的自動癥、涎分泌等植物神經(jīng)癥狀、頭部的自動癥”到“單側(cè)上肢的抽搐、雙側(cè)上肢的抽搐”,最后擴展到“下肢陣攣、身體強直陣攣”的全部發(fā)作過程,模型的發(fā)作形式與人類顳葉癲癇的發(fā)作形式極為一致。本模型中,海馬CA3區(qū)的錐體細胞和海馬齒狀回的神經(jīng)細胞在海人酸注射后,伴隨著癲癇發(fā)作,逐漸缺失減少,最后CA3區(qū)域的神經(jīng)元幾乎全部缺失。海人酸是從日本的一種天然海藻中提取的興奮性氨基酸-谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,注射后,與海馬齒狀回中顆粒細胞的軸突末梢上的海人酸受體結(jié)合,增加突觸末梢膜的通透性,使顆粒細胞中的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)-谷氨酸大量釋放、重吸收減少,引起突觸后神經(jīng)元-海馬CA3區(qū)域的錐體細胞的過度興奮毒性,連同谷氨酸本身對CA3區(qū)域的錐體細胞的興奮毒性作用,使CA3區(qū)域的錐體細胞逐漸減少甚至完全缺失。海馬齒狀回中有大量的中間神經(jīng)元,包括γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,這些中間神經(jīng)元聯(lián)系廣泛,代謝活躍,因此對氧的變化非常敏感。每一次癲癇發(fā)作均會使腦組織出現(xiàn)乏氧的情況,使海馬齒狀回中的中間神經(jīng)元因缺氧而出現(xiàn)水腫、變性甚至死亡,因此,在模型的病理改變中,可以觀察到齒狀回神經(jīng)元的逐漸減少缺失。在模型的病理變化中,尚可觀察到神經(jīng)元缺失的區(qū)域出現(xiàn)膠質(zhì)細胞增生,形成膠質(zhì)團塊。這樣的病理改變同人類顳葉癲癇的病理變化——海馬硬化極其一致。成功的癲癇模型,其發(fā)作形式和腦電活動必須與人類一致,至少要有腦電的癲癇改變。本模型中,癲癇的棘波放電起源于一側(cè)海馬,然后迅速在邊緣系統(tǒng)中傳播擴布,并可擴布到全腦的皮質(zhì),引起相應的一次顳葉癲癇發(fā)作。其癲癇之異常電活動的形式與人類顳葉癲癇也是一致的。海人酸引發(fā)的顳葉癲癇發(fā)作具有長期的癲癇敏感性。首先,海人酸本身的神經(jīng)興奮毒性和其引起的傳導性神經(jīng)興奮毒性使海馬內(nèi)的興奮-抑制平衡遭到破壞,引發(fā)癲癇發(fā)作,造成海馬神經(jīng)元的減少、缺失以及隨后的膠質(zhì)細胞增生。其次,在海馬神經(jīng)元的減少中,齒狀回中以γ-氨基丁酸能神經(jīng)元為主的抑制性中間神經(jīng)元的減少又使海馬內(nèi)的興奮-抑制平衡進一步破壞,這樣,海馬神經(jīng)元的減少和缺失便從癲癇發(fā)作的結(jié)果變成了再次癲癇發(fā)作的原因,如此以來,興奮-抑制平衡的破壞和海馬神經(jīng)元的減少