實(shí)驗(yàn)一-植物細(xì)胞有絲分裂及染色體行為的觀察

遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師：劉振蘭

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生命科學(xué)學(xué)院北樓607室顯微鏡使用注意事項(xiàng)每次使用之后要登記（登記本在顯微鏡下的抽屜里,請(qǐng)注意你使用的顯微鏡后面的編號(hào)和記錄本上面的編號(hào)要一致）；使用完后請(qǐng)把載物臺(tái)按逆時(shí)針方向調(diào)到最低位置,4X物鏡放到光路中間，并將電壓調(diào)至最??；不要拖動(dòng)顯微鏡，如需調(diào)整位置請(qǐng)搬動(dòng)顯微鏡的底部抬起移動(dòng)；請(qǐng)不要使用100X油鏡去觀察樣品!!!顯微鏡是貴重儀器,請(qǐng)大家小心愛護(hù)使用。謝謝!遺傳學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)性的學(xué)科。它的每一步發(fā)展都是以實(shí)驗(yàn)作為基礎(chǔ)的。因而實(shí)驗(yàn)教學(xué)是教學(xué)中非常重要的組成部分。通過(guò)實(shí)驗(yàn)課我們要學(xué)習(xí)什么？遺傳學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法的訓(xùn)練和基本規(guī)律的驗(yàn)證－基本技能的訓(xùn)練；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力和科學(xué)研究素質(zhì)的培養(yǎng)；強(qiáng)調(diào)理論與實(shí)踐相結(jié)合，培養(yǎng)和鍛煉學(xué)生用所學(xué)知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題的能力。參考書目《遺傳學(xué)分析實(shí)驗(yàn)教程》喬守怡主編，高等教育出版社2008年1月第一版；《遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)》李雅軒、趙昕主編，科學(xué)出版社2006年5月第一版；《遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》盧龍斗、常重杰主編，科學(xué)出版社2007年9月第一版；《遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)》劉祖洞、江紹慧編，高等教育出版社1987年11月第二版。課程評(píng)價(jià)成績(jī)主要由課程考勤、上課表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)報(bào)告三部分組成。請(qǐng)認(rèn)真獨(dú)立的完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，嚴(yán)禁抄襲及杜撰實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)！請(qǐng)用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙；實(shí)驗(yàn)報(bào)告的內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理主要試劑及材料實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（請(qǐng)用鉛筆繪圖）作業(yè)及思考題當(dāng)節(jié)課的實(shí)驗(yàn)報(bào)告下次課交上來(lái)。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的要求植物遺傳學(xué)系列動(dòng)物及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系列微生物遺傳學(xué)系列果蠅遺傳學(xué)系列數(shù)量與群體遺傳學(xué)系列分子遺傳學(xué)系列遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容植物細(xì)胞有絲分裂及染色體行為的觀察（316）植物細(xì)胞減數(shù)分裂及染色體行為的觀察（316）果蠅的飼養(yǎng)及形態(tài)觀察（324）果蠅的有性雜交（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）（324）植物有性雜交技術(shù)（田間試驗(yàn)）輻射誘變對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的影響（316）人工誘發(fā)多倍體植物（316）大腸桿菌乳糖操縱子基因的表達(dá)調(diào)控（324）實(shí)驗(yàn)一植物細(xì)胞有絲分裂及染色體行為的觀察有絲分裂中的紡錘體

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握植物染色體壓片法；觀察植物細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中染色體的形態(tài)特征和動(dòng)態(tài)變化，識(shí)別有絲分裂的不同時(shí)期。二、實(shí)驗(yàn)原理動(dòng)植物的許多組織細(xì)胞都進(jìn)行有絲分裂。高等植物的根尖和莖端分生組織，高等動(dòng)物的骨髓和一些上皮組織，都是觀察有絲分裂現(xiàn)象的適宜部位。由于各個(gè)細(xì)胞的分裂是獨(dú)立進(jìn)行的，因此在同一組織中可以看到不同分裂時(shí)期的細(xì)胞。通過(guò)觀察各個(gè)時(shí)期內(nèi)染色體（或染色質(zhì)）的存在狀態(tài)，就可以判斷這些細(xì)胞各處于有絲分裂的哪個(gè)時(shí)期，進(jìn)而認(rèn)識(shí)有絲分裂的完整過(guò)程。通過(guò)有絲分裂和細(xì)胞分化，DNA準(zhǔn)確地在細(xì)胞世代間相傳，實(shí)現(xiàn)組織發(fā)生和個(gè)體發(fā)育。

三、實(shí)驗(yàn)步驟取材固定解離染色壓片操作鏡檢

1.取材

本實(shí)驗(yàn)以洋蔥為材料，在室內(nèi)(25度)培養(yǎng)根尖。用廣口瓶裝滿水，把洋蔥放在瓶口上，使洋蔥的鱗莖盤與水充分接觸，每天換水促進(jìn)生長(zhǎng)，生根前去掉洋蔥外面干燥膜狀鱗葉，以免污染瓶水，抑制生根。

不定根1.5-2cm時(shí)取材固定或進(jìn)行預(yù)處理。洋蔥根尖細(xì)胞以上午6-9時(shí)為分裂高峰期。根尖由于取材方便，是觀察植物染色體最常用的材料。根尖染色體壓片法，是觀察植物染色體最常用的方法，也是研究染色體組型、染色體分帶、染色體畸變和姐妹染色單體交換的基礎(chǔ)。2.固定

采用滲透力強(qiáng)的固定液將植物組織、細(xì)胞迅速殺死，使蛋白質(zhì)沉淀，使植物材料保持原有狀態(tài)。固定方法：將植物材料用蒸餾水沖洗2次→轉(zhuǎn)移到卡諾氏固定液中→固定3～24h。固定后的材料可以轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中,在4度冰箱中保存，但保存時(shí)間最好不超過(guò)2個(gè)月。固定的目的：迅速防止細(xì)胞死亡后的變化，防止自溶、腐敗，盡量保持生長(zhǎng)狀態(tài)結(jié)構(gòu)；使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持活體的形態(tài)；使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定；使不同組織成分對(duì)染料有不同的親和力，便于染色；防止細(xì)胞過(guò)度收縮或膨脹，失去原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。3.解離常用酸解法和酶解法；酸解法：固定后的材料用清水沖洗，放入1mol/L的HCl中60℃處理5～10min。注意：掌握好溫度和時(shí)間，若解離時(shí)間不夠，則壓片不易分散；解離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，下一步處理時(shí)由于材料過(guò)軟而易將根尖丟失。解離的目的是使分生組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解,細(xì)胞壁軟化或部分分解,使細(xì)胞和染色體容易分散壓平。酸解優(yōu)點(diǎn)：制片清潔，染色體清晰，組織軟化好，易于壓片。缺點(diǎn)：染色體較軟，容易纏繞，不易分散；對(duì)小型染色體的材料效果較差。注意：酸解是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一。酸解溫度應(yīng)保持在60（上下浮動(dòng)不超過(guò)0.5度），如果溫度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短，酸解不夠，醛基暴露不充分，染色會(huì)過(guò)淺；若溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成酸解過(guò)度，使DNA完全解聚，糖與醛基之間的鍵被破壞，游離的核酸分子會(huì)擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，從而造成染色淺或不均一的現(xiàn)象。酸解法是用鹽酸水解根尖，步驟簡(jiǎn)便、容易掌握，廣泛應(yīng)用于染色體計(jì)數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察。根尖分生組織經(jīng)過(guò)酸解和壓片后，都呈單細(xì)胞，但是大部分分裂細(xì)胞的染色體還包在細(xì)胞壁中間。4.染色解離后的材料用蒸餾水沖洗，將根冠和伸長(zhǎng)區(qū)切除，只留分生區(qū)部分→將根尖置于載玻片上，加一滴染色液，5～10min。5.壓片操作蓋上蓋玻片，在酒精燈火焰上過(guò)3～4次，以手背感覺玻片微燙為宜。此步驟是使材料更易軟化和著色，并破壞部分細(xì)胞質(zhì)使染色背景清晰。若室內(nèi)氣溫較高或認(rèn)為染色效果較好，也可省去此步驟。用左手拇指壓住蓋玻片的一角，右手拿鉛筆（橡皮頭朝下）垂直敲蓋玻片幾下，將材料震散。注意用力均勻，確保兩玻片不錯(cuò)動(dòng)，將材料壓成薄薄一層，即可放在顯微鏡下觀察。6.鏡檢壓好的片先在低倍鏡下鏡檢，找到分裂細(xì)胞后，再轉(zhuǎn)換成高倍鏡觀察染色體動(dòng)態(tài)變化。如果染色體分散良好，圖像清晰，可以進(jìn)行顯微照相保存。一個(gè)解離良好的材料，只要用鑷子尖輕輕敲打蓋玻片，分生組織細(xì)胞就可以鋪展成薄薄的一層，再用毛邊紙把多余的染色液吸干，經(jīng)顯微鏡檢查后，選擇理想的分裂細(xì)胞，再在這個(gè)細(xì)胞附近輕輕敲打，使重疊的染色體漸漸分散，就能得到理想的分裂相。注意事項(xiàng)壓片材料要少，避免細(xì)胞緊貼在一起，致使細(xì)胞和染色體沒有伸展的余地；解離時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，以免染色體結(jié)構(gòu)受損；解離后水洗要徹底，否則不易著色；用鑷子敲打蓋玻片時(shí)，用力要均勻，若在壓片時(shí)稍不留意，會(huì)使個(gè)別染色體丟失，而被迫放棄一個(gè)良好的分裂相細(xì)胞；防止出氣泡。作業(yè)及思考題繪出在顯微鏡下觀察到的有絲分裂各時(shí)期的示意圖。為了便于觀察有絲分裂的過(guò)程及其中染色體的動(dòng)態(tài)變化，最好應(yīng)該選擇什么樣的材料，為什么？你觀察到的洋蔥染色體有絲分裂以什么時(shí)期為最多？染色體和染色質(zhì)互變、染色體加倍各發(fā)生在什么時(shí)期？醋酸洋紅將洋紅粉末1g倒入100mL45%醋酸溶液中，邊煮邊攪拌，煮沸(沸騰時(shí)間不超過(guò)30s)，然后懸入一生銹的小鐵釘于染液中，過(guò)1min取出，或加入1%～2%鐵明礬水溶液5-10滴，至此液變?yōu)榘导t色而不發(fā)生沉淀為止。靜置12h后，過(guò)濾于一棕色試劑瓶中，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。配制方法：先配成三種原液,再配成染色液

原液A:3g堿性品紅溶于100ml70%酒精中.

原液B:取原液A10ml加入到90ml5%石炭酸水溶液中.

原液C:.取原液B55ml,加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林(38%的甲醛).

(原液A和原液C可長(zhǎng)期保存,原液B限兩周內(nèi)使用).

染色液:取C液10—20m1,加45%冰醋酸80～90ml,再加山梨醇1.8