一種新的可放大的重組腺病毒載體的純化方法

ANewScalablｅMethodfoｒｔhePurｉfｉcａｔionｏｆＲecombiｎａnｔAdeｎovirusVｅcｔors一種新的可放大的重組腺病毒載體的純化方法摘要：重組腺病毒是各種基因治療的首選載體.但是，這種載體的規(guī)?；M(jìn)展的生產(chǎn)和平安性仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。另外，對(duì)于這種載體,任何環(huán)節(jié)都必須有充分的證據(jù)來(lái)確定其的免疫性和毒性。很多可供選擇的在柱層析的基礎(chǔ)上再用經(jīng)典的CsCl梯度離心純化的方法已經(jīng)形成了,但是第一代的純化過(guò)程在潛在的應(yīng)用方面還是有肯定的缺陷。本文報(bào)道的是一種將兩種樹(shù)脂層析柱串聯(lián)的協(xié)同作用的方法來(lái)純化腺病毒,分別為aｎiｏn－ｅｘｃhanｇe(離子交換柱）和PolyＦlo柱.ＰｏlyFlo柱起到的作用是去除離子交換柱不能除去的宿主細(xì)胞蛋白和病毒蛋白.以β-半乳糖苷酶做報(bào)告基因的腺病毒載體，H5.CMＶ—ｌaｃZ，過(guò)高效液相色譜（HPLＣ），SDS-PＡＳGＥ（銀染),Westerｎ分析,電子顯微鏡，VP：ＩU等分析方法，分別與單純的2×ＣsCl密度離心純化法和離子交換法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩步串聯(lián)法的提純的腺病毒載體純度更高.另外，腺病毒的回收率比２×ＣsCl離心純化法明顯高，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第一代的離子交換法。并且整個(gè)過(guò)程可以再生和放大,每次過(guò)柱的進(jìn)樣量為可達(dá)到１０15的病毒顆粒。更重要的是，這種方法純化的腺病毒在4℃，—20℃,－7５℃，可以保持穩(wěn)定，在多輪的反復(fù)凍融后仍然完整。最后，這種方法純化的病毒純度高,易放大,不用離心.本文整體總結(jié)（ｏvervｉｅｗsuｍmary)重組腺病毒是格外有前景的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，由于其高效的瞬時(shí)基因表達(dá)能力和高效的轉(zhuǎn)染能力而被用于基因治療。但是，如何生產(chǎn)大量的高純的成規(guī)模的能滿意臨床評(píng)估和產(chǎn)量的純化方法確成為一個(gè)重要的問(wèn)題。我們研發(fā)的一種串聯(lián)層析柱的方法能夠提高重組腺病毒的純化，在本文中將從純度、平安性、完整性、功能性（效價(jià)）和規(guī)?；确矫孀C明它的純化過(guò)程.簡(jiǎn)介(intrｏｄuctｉｏn）在過(guò)去的10年中，重組腺病毒(ｒAd)載體在基因治療領(lǐng)域引起人們極大的愛(ài)好。它在活體內(nèi)具有高效的轉(zhuǎn)基因能力，能夠轉(zhuǎn)染各種野生型細(xì)胞，包括需要格外高基因表達(dá)能力的造血干（祖)細(xì)胞。但是,目前的一些討論表明病毒載體或者表達(dá)的基因產(chǎn)物能夠引起對(duì)細(xì)胞和人體的免疫反應(yīng)，這些會(huì)增加毒性和免疫原性。這會(huì)削弱重組基因的表達(dá)從而降低腺病毒載體的基因治療效果。純化過(guò)程中殘余的病毒成份會(huì)引起炎癥反應(yīng)，而這些免疫反應(yīng)或許隨后就開(kāi)頭啟動(dòng).格外的是，最近的討論證明，當(dāng)把整個(gè)腺病毒的一個(gè)組份或者游離的蛋白在人體內(nèi)消滅時(shí)，腺它以一種劑量依靠的方式類似一種佐劑而引起免疫反應(yīng)。所以，近年來(lái)在腺病毒領(lǐng)域的進(jìn)展主要集中在腺病毒和生產(chǎn)過(guò)程的改進(jìn)，以使毒性最小化和削減免疫反應(yīng)，從而提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效果和穩(wěn)定性。為了改進(jìn)腺病毒的生產(chǎn)，研發(fā)可放大的純化方法有了新的突破。Hｕygｈｅ等發(fā)明的方法是首先使用離子交換柱粗純化病毒,然后再用固定化金屬離子層析(ＩＭAＣ)作為精純化病毒.Blaｎchｅ等通過(guò)單獨(dú)或者循環(huán)使用離子交換柱生產(chǎn)高質(zhì)量的腺病毒。這些第一代的柱層析法在純度和產(chǎn)量方面彌補(bǔ)了2×CｓＣl密度離心純化法的不足。但是作為一種基礎(chǔ)的化學(xué)純化技術(shù)的這種第一代的柱層析法在生產(chǎn)腺病毒的純度方面卻不能與2×ＣsCl密度離心純化法相媲美甚至不能比它更好。所以在第一代柱層析法的基礎(chǔ)上還需要精純化。在這些關(guān)于純化的文獻(xiàn)中最大規(guī)模病毒顆粒承載量只有為1013,最后產(chǎn)品的回收率也格外低,在Huｙghe的方法中大約只有３２%,在Blａｎcｈe的方法只有40%。如此同時(shí),很多消滅在國(guó)家會(huì)議或者公司的專利中的一些純化方法，仍然有很多局限性。實(shí)驗(yàn)總是引導(dǎo)改進(jìn)腺病毒的純化方法.我們發(fā)明白一種串聯(lián)層析柱法，第一步利用離子層析法吸附病毒，其次步再用PｏｌｙＦlｏ層析柱來(lái)進(jìn)行精純化.實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，PｏｌyFｌo層析柱能夠區(qū)分細(xì)胞蛋白、游離的病毒蛋白碎片與完整的病毒顆粒，從而能夠去除這些在離子交換法（第一步)中不能去除雜質(zhì)。通過(guò)不同的病毒收獲方法，從純度、可放大性、再次利用方面對(duì)這種串聯(lián)純化法進(jìn)行評(píng)估。一．實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)譯1．待純化的病毒懸液的制備病毒是E1/Ｅ4缺失的ｒAdH5．CMＶ—lａｃZ，用于擴(kuò)增病毒的是HEK－２93細(xì)胞，以不同的MＯI將病毒加入到細(xì)胞中，感染過(guò)程持續(xù)2-５天后收獲。由于病毒的擴(kuò)增方法有不同,病毒的釋放方式有兩種.一種是染毒５天后收集全部液體，處理后用柱層法純化,方法見(jiàn)后。一種是染毒后2—4天收集細(xì)胞懸液離心后,細(xì)胞沉淀層用ＰBＳ洗一次，然后反復(fù)凍融3次,重懸,先用１．2ｕｍ過(guò)濾,再用0．２ｕm過(guò)濾，病毒懸液保存在—７5℃?zhèn)溆谩?.細(xì)胞完全自然裂開(kāi)的病毒溶解物澄清液的制備病毒溶解樣品首先通過(guò)一級(jí)粗濾使其變得澄清，然后通過(guò)二級(jí)過(guò)濾吸附而將病毒濃縮，濃度可以濃縮８—１0倍。病毒粗提液保存在—75℃?zhèn)溆谩?．離子交換層析常規(guī)的離子交換層析將前兩步處理的澄清病毒液通過(guò)DＥAＥ樹(shù)脂進(jìn)行層析純化,去除的雜質(zhì)。然后加洗脫液，收集純化的病毒液，－75℃保存.從純度、回收率、生物活性等方面進(jìn)行檢測(cè)。ＰolyＦｌoFloｗ－Ｔhrough層析（ＰF－ＦT法)將第３步離子交換層析收集的病毒液通過(guò)PｏｌyFlo柱層析再次進(jìn)行精純化。這一步的原理是PolｙFｌｏ柱可以吸附一些離子交換層析法未能去除細(xì)胞蛋白,游離的病毒蛋白碎片，而不吸附病毒顆粒,從而達(dá)到純化病毒的目的.收集的病毒液通過(guò)0.22um過(guò)濾后，—75℃保存.從純度、回收率、生物活性等方面進(jìn)行檢測(cè).5。SDＳ-ＰAＧE和Wesｔern分析SＤＳ-PAＧＥ分析各種方法純化的腺病毒中的蛋白含量。Wｅｓｔｅrn用來(lái)檢測(cè)腺病毒的有無(wú)。６．感染活性、轉(zhuǎn)染效率和回收率感染活性通過(guò)３天的MOI來(lái)評(píng)估，轉(zhuǎn)基因表達(dá)活性通過(guò)β－半乳糖苷酶來(lái)檢測(cè).回收率通過(guò)回收后病毒感染顆粒數(shù)與負(fù)荷的病毒感染顆粒數(shù)的比值來(lái)計(jì)算.用microＢCA法用來(lái)檢測(cè)蛋白含量。７。病毒顆粒的定量通過(guò)ＲesourｃeQHPLC(高效液相色譜）來(lái)評(píng)估純化后的病毒顆粒的純度和濃度。8.殘余物分析殘存的宿主細(xì)胞蛋白用抗29３細(xì)胞的抗體通過(guò)Wesｔern來(lái)檢測(cè)。殘余的內(nèi)毒素通過(guò)凝膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。殘存的宿主DＮA用２９3特異的探針通過(guò)定量的slot—ｂlot分析。殘存的ＤＮA酶通過(guò)ＥLＩSA試劑盒檢測(cè)。９．電鏡檢查病毒顆粒的完整性。１0。病毒穩(wěn)定性檢測(cè)將收獲的病毒液制備成同一濃度,分裝在各種微型試管中,分別保存于在4℃，-２０℃,-75℃,不同時(shí)間抽樣檢測(cè),通過(guò)HPLC檢測(cè)顆粒數(shù)，通過(guò)CＰE檢測(cè)感染活性,通過(guò)β-半乳糖苷酶的表達(dá)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)活性。另外還檢測(cè)了病毒經(jīng)過(guò)—7５℃/室溫反復(fù)凍融后的穩(wěn)定性。二．結(jié)果1.用于層析的細(xì)胞溶解物的制備的分析首先討論的是染毒后２-４天收集的病毒懸液(細(xì)胞需要離心并反復(fù)凍融三次)與染毒后直至細(xì)胞完全崩解(一般4－5天）的病毒懸液（細(xì)胞不需要反復(fù)凍融）之間的差別，通過(guò)HＰLC能夠檢測(cè)所含病毒分子和各種雜質(zhì)之間比例的不同。在染毒后５天收獲與標(biāo)準(zhǔn)的染毒２天后收獲相比,5天后收獲的樣品所含病毒比例明顯增加，DNA的含量則比較少.另外，２天后收獲的樣品蛋白含量較少和血清成份則沒(méi)有，這反映出了收獲和清洗細(xì)胞沉淀層的方法可以去除大部分的培育液中的成分（包括培育液的成分和細(xì)胞的代謝產(chǎn)物)。第5天收獲的樣品與第２天收獲的樣品相比病毒顆粒：DNA復(fù)合物的比值減小。５天收獲的病毒液,病毒顆粒與活性顆粒的比值會(huì)下降。HPLC結(jié)果顯示,細(xì)胞完全裂開(kāi)的病毒懸液通過(guò)過(guò)濾可以去除了大部分的細(xì)胞和病毒的蛋白,以及血清殘留物,過(guò)濾后病毒的回收率達(dá)到８5％(少部分被膜吸附).２.離子交換層析由于腺病毒有酸性的pI，這決定了樹(shù)脂可以選擇性的結(jié)合腺病毒,從而將腺病毒從含有細(xì)胞組分、病毒雜質(zhì),DＮA的細(xì)胞裂解物中純化出來(lái)。樹(shù)脂對(duì)腺病毒有良好的結(jié)合能力和優(yōu)秀的純化效率,純化后的濃度可以達(dá)到５×10１2個(gè)/ml病毒顆粒。純化后的病毒進(jìn)行SＤS－ＰAGE分析發(fā)現(xiàn)，仍然有少量的明顯的蛋白雜質(zhì)。這種純化方法,病毒顆?；厥章蔬_(dá)到７5％，具有感染性的病毒顆?；厥章蔬_(dá)到7５%—90%.3.ＰｏlyFloFｌｏw-Ｔhrough層析（PF－ＦＴ法）該步驟的作用:完整的病毒顆粒不能結(jié)合在PoｌyFlo層析柱上，但是宿主的蛋白和病毒蛋白雜質(zhì)能結(jié)合上,從而達(dá)到對(duì)腺病毒的精純化。PF—FＴ法純化的病毒液SDS－PAGＥ的結(jié)果表明，沒(méi)有觀察到明顯的蛋白條帶。但是將柱子再洗脫后，收集的液體（包含被除去的蛋白雜質(zhì))SＤS-PＡGE，可以觀察到少量的蛋白。左圖為2９３蛋白的特異性Wesｔｅrnｂlｏt結(jié)果1道為病毒澄清液左圖為2９３蛋白的特異性Wesｔｅrnｂlｏt結(jié)果1道為病毒澄清液2道為DEＡＥ法提純病毒液3道為DEAE／PF—FT串聯(lián)法提純病毒液4道為2×CsCｌ梯度離心法提純病毒液１道為澄清的病毒懸液(粗提純)2道為離子交換層析法提純ＤEAE3道為DＥＡE/PＦ-ＦＴ串聯(lián)法４道為2×CｓＣｌ梯度離心法這種PＦ-ＦＴ法，上樣量為1014時(shí)回收率為8４%,上樣量為１01５時(shí)回收率為78％。收獲的具有感染性的病毒顆粒的回收率(９0％）明顯高于單純的CsCl梯度離心法和離子交換法。4．產(chǎn)物的分析（1)DＥAＥ/ＰF—ＦT串聯(lián)法純化的腺病毒純的格外的高，HPＬC顯示只有一個(gè)峰。另外，SDS－PＡGE檢測(cè)表明，與單純的離子交換比較，DＥＡE/PF—ＦT法成功去除宿主細(xì)胞蛋白，以及游離的病毒蛋白。DEＡE/PF—FT法的純度與２×ＣsCl梯度離心法相當(dāng)。左圖為檢測(cè)蛋白含量的SDS結(jié)果左圖為檢測(cè)蛋白含量的SDS結(jié)果1道為病毒澄清液2道為DＥAE法提純病毒液3道為DEＡＥ/PＦ－FT串聯(lián)法提純病毒液4道為２×ＣsＣｌ梯度離心法提純病毒液（2）電子顯微鏡的結(jié)果表明,ＤＥAE／PF-FT串聯(lián)純化的病毒顆粒都是六面體或者五面體，與2×ＣｓＣl梯度離心法結(jié)果全都.（3)DEAＥ/PＦ－FT串聯(lián)純化的腺病毒的VP:IＵ大約為1：1,低于經(jīng)典的2×CsＣl梯度離心法50：１，小于ＦＤＡ規(guī)定的３0:1。5.產(chǎn)品的穩(wěn)定性左圖為蛋白的SDS-