HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南

本指南由中國疾病防止控制中心性病艾滋病防止控制中心艾滋病參比實驗室組織有關(guān)專家撰寫，由中國疾病防止控制中心同意執(zhí)行。編寫主持人：蔣巖編寫人員：潘品良蔣巖李敬云鐘平尚紅李太生審核咨詢專家及技術(shù)人員：邵一鳴康來儀朱效科王佑春汪寧朱紅郭志宏季陽劉海林肖瑤邱茂鋒馬春濤編寫單位：中國疾病防止控制中心性病艾滋病防止控制中心參編單位：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海市疾病防止控制中心中國醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院技術(shù)顧問：MikeUssery,HaoZhang美國國立衛(wèi)生研究院過敏及傳染病研究所JamesW.Bremer美國Rush大學(xué)醫(yī)學(xué)中心VQA實驗室TreverPeter克林頓基金中國艾滋病防治項目實驗室專家DonaldJ.Brambilla美國華盛頓大學(xué)新英格蘭研究所FrancisF.Mandy加拿大公共衛(wèi)生局疾病防止控制中心國家免疫學(xué)實驗室

前言隨著HIV-1病毒載量檢測在艾滋病臨床輔助診療和抗病毒治療監(jiān)測以及艾滋病科研工作中的廣泛應(yīng)用，我國開展該項檢測工作的實驗室日益增多。自1997年艾滋病實驗室初次引進(jìn)HIV-1病毒載量檢測技術(shù)，截至底，全國已經(jīng)配備了近120臺HIV-1病毒載量檢測儀，覆蓋了疾控、醫(yī)院、檢疫、軍隊等系統(tǒng)?，F(xiàn)在，即使許多實驗室已經(jīng)將病毒載量檢測納入艾滋病有關(guān)輔助診療和治療監(jiān)測工作，但大多數(shù)實驗室開展工作的時間較短，經(jīng)驗局限性，因此，急需加強(qiáng)該領(lǐng)域的培訓(xùn)和質(zhì)量控制工作，以確保檢測成果的精確性和可靠性。為了加強(qiáng)質(zhì)控和確保檢測質(zhì)量，并得到國際上的承認(rèn)，艾滋病參比實驗室開始參加美國NIH組織的HIV-1病毒載量檢測能力驗證工作。在通過考核和積累經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，啟動了國內(nèi)HIV-1病毒載量檢測能力驗證工作。在主動組織實驗室能力驗證的同時，艾滋病參比實驗室也對實驗室技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)，主動開展室內(nèi)質(zhì)控。這些工作對提高HIV-1病毒載量的檢測技術(shù)，確保質(zhì)量起到了重要作用。為了進(jìn)一步規(guī)范艾滋病實驗室HIV-1病毒載量檢測，建立原則化質(zhì)量控制程序，精確開展各項檢測及質(zhì)量控制工作，特制訂本指南。本指南是根據(jù)多個HIV-1病毒載量檢測辦法的技術(shù)規(guī)定，結(jié)合現(xiàn)行的國內(nèi)外有關(guān)技術(shù)規(guī)范而制訂。本指南針對HIV-1病毒載量檢測的實驗室設(shè)立、樣品管理、檢測技術(shù)、質(zhì)量控制、生物安全等方面提出指導(dǎo)。本指南自初正式開始編寫，性病艾滋病防止控制中心多次組織了有國內(nèi)外專家參加的指南編寫專項技術(shù)咨詢會，與會專家對指南提出了諸多建設(shè)性意見和建議，美國NIH病毒載量檢測質(zhì)量確保明驗室專家多次對指南進(jìn)行認(rèn)真的審視和具體指導(dǎo)。指南編寫過程中，也認(rèn)真聽取了實驗室一線檢測人員的具體需求和建議，并補(bǔ)充了大量的實驗數(shù)據(jù)，涉及HIV-1病毒載量檢測值的穩(wěn)定性、凍融影響實驗與不同檢測辦法之間比較的實驗數(shù)據(jù)等。在此基礎(chǔ)上，通過多次修訂、補(bǔ)充和審定，于11月完畢《HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量確保指南》的最后定稿。由于國內(nèi)外還沒有可作為參考的HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量控制的有關(guān)指南，因此本指南重要提出某些原則上的參考建議，其中定有不當(dāng)之處，但愿廣大同仁提出意見，方便不停完善。致謝在本指南的編寫過程中，世界衛(wèi)生組織、克林頓基金中國艾滋病防治項目和美國NIH等國際組織與機(jī)構(gòu)予以了大力支持，全國HIV-1病毒載量檢測實驗室一線操作人員提出了許多建設(shè)性的意見和具體需求，艾滋病參比實驗室工作人員毛瑋、陶曉霞進(jìn)行了大量的補(bǔ)充實驗和文字編輯工作，才確保本指南的編寫順利完畢，在此一并向他們表達(dá)真誠的感謝。中國疾病防止控制中心性病艾滋病防止控制中心主任吳尊友研究員在本指南編寫過程中提出了重要的修改意見，在此特別致謝。

HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量確保指南（）目錄總則實驗室設(shè)立樣品的采集、解決、保存、運(yùn)輸慣用HIV-1病毒載量檢測辦法介紹室內(nèi)質(zhì)量控制外部質(zhì)量控制實驗室生物安全附表1常見問題分析和解決附表2HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接受單附表3HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接受專用單附表4HIV-1病毒載量檢測報告單附表5HIV-1病毒載量能力驗證成果專用報告單（NASBA)附表6HIV-1病毒載量能力驗證成果專用報告單（RT-PCR)參考文獻(xiàn)縮略語

第一章總則1.1意義HIV-1病毒載量是艾滋病防治工作中一項重要的實驗室檢測指標(biāo)。檢測HIV-1病毒載量能夠監(jiān)控和預(yù)測病程，指導(dǎo)艾滋病患者的抗病毒治療，涉及擬定治療時機(jī)、選擇治療方案、評價治療效果；結(jié)合疾病臨床癥狀和其它實驗指標(biāo)，可作為早期感染診療的輔助手段；還可用于嬰兒早期感染的輔助診療以及采供血機(jī)構(gòu)樣品的窗口期檢測。為了精確地檢測HIV-1病毒載量，必須對開展HIV-1病毒載量檢測的實驗室進(jìn)行規(guī)范化管理和質(zhì)量控制，才干確保檢測成果的精確性和可靠性。1.2目的指導(dǎo)HIV-1病毒載量檢測工作，規(guī)范實驗室質(zhì)量控制與管理。1.3合用范疇合用于我國開展HIV-1病毒載量檢測工作的全部實驗室。

第二章實驗室設(shè)立多個HIV-1病毒載量檢測辦法需要對應(yīng)的輔助設(shè)備才干完畢檢測。下列為HIV-1病毒載量檢測實驗室不同分區(qū)內(nèi)必備的輔助設(shè)備及耗材。2.1樣品解決區(qū)：2.1.1生物安全柜：二級2.1.2離心機(jī)（3g，可離心1.5mL管子）2.1.3冰箱：4℃，-20℃，-80℃2.1.4水浴箱：精確度不大于0.5℃2.1.5加樣器1套（20μL、200μL、1000μL），為專用設(shè)備2.1.6有濾芯的一次性吸頭（無DNA和RNA酶）2.1.7計時器2.1.8旋渦振蕩器：震動頻率可調(diào)2.1.9一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.2試劑準(zhǔn)備區(qū)：2.2.1超凈工作臺（或密閉工作臺）2.2.2加樣器1套（20μL、200μL、1000μL），為專用設(shè)備2.2.3離心機(jī)（18000g，可離心1.5mL管子）2.2.4冰箱：4℃，-20℃2.2.5計時器2.2.6旋渦振蕩器，震動頻率可調(diào)2.2.7有濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）2.2.81.5mL管子（無DNA和RNA酶）和1.5mL試管架2.2.9一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.3擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：2.3.1HIV-1病毒載量檢測儀2.3.2加樣器1套（20μL、200μL、1000μL）2.3.3冰箱：4℃，-20℃2.3.4水浴箱(41℃)2.3.5旋渦振蕩器：震動頻率可調(diào)2.3.6有濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）2.3.7一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.4HIV-1病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布示意圖HIV-1病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布示意圖病毒載量儀,加樣器病毒載量儀,加樣器離心機(jī)離心機(jī)冰箱-20，4冰箱-20，4℃水浴箱水浴箱洗手洗手池紫外燈擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)生物安全柜生物安全柜加樣器離心機(jī)離心機(jī)冰箱-80，-20冰箱-80，-20℃冰箱水浴箱水浴箱洗手洗手池紫外燈樣品解決區(qū)超凈工作臺超凈工作臺加樣器漩渦振蕩漩渦振蕩器冰箱-20，4℃實驗臺冰箱-20，4℃實驗臺紫外燈紫外燈試劑準(zhǔn)備區(qū)2.4.1總體原則：各區(qū)獨立、控制風(fēng)向、因地制宜、方便工作。具體來說：2.4.1.1各區(qū)必須是互相獨立的，有條件各區(qū)內(nèi)可分別設(shè)立緩沖間，以確保不同區(qū)之間始終完全分隔開。2.4.1.2各區(qū)的儀器設(shè)備以及多個物品必須是專用的。2.4.1.3試劑準(zhǔn)備區(qū)和樣品解決區(qū)可保持低度正壓（或常壓）狀態(tài)，使空氣流向始終由室內(nèi)向外，以避免擴(kuò)增污染物進(jìn)入此區(qū)域。2.4.1.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可保持低度負(fù)壓狀態(tài)，使空氣流向始終由室外向內(nèi)，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物造成其它區(qū)域的交叉污染?？砂惭b排電扇或其它排風(fēng)裝置。2.4.1.5擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)能夠設(shè)在遠(yuǎn)離其它各區(qū)的地方。2.4.1.6工作時必須遵照單一工作流向進(jìn)行，即工作流向只能從試劑準(zhǔn)備區(qū)開始，到樣品解決區(qū)，然后再到擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

第三章樣品的采集、解決、保存和運(yùn)輸樣品采集、解決、保存和運(yùn)輸，按照所使用檢測辦法的規(guī)定嚴(yán)格執(zhí)行。用于HIV-1病毒載量檢測的樣品推薦采用抗凝血漿。3.1樣品的采集采樣器材：一次性抗凝真空采血管、持針器、蝶形針等。抗凝劑：普通采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸櫞酸鈉），并符合不同檢測辦法對樣品的規(guī)定。樣品標(biāo)記：在采血管上貼對應(yīng)的樣品編號，并填寫HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接受單（附表2）。樣品采集量：普通采集全血3～5ml,采集的樣品量應(yīng)盡量與定量采血管的刻度一致，采集量過多或局限性，會造成血液凝固或被稀釋。樣品的混勻：采集血液后，立刻輕輕上下顛倒抗凝管約10次，使血液與抗凝劑充足混勻。獲取其它信息：涉及采集對象的基本信息和流行病學(xué)資料，抗病毒藥品使用狀況，以往的實驗室檢測成果，在HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接受單（附表2）上備注欄注明。3.2樣品的解決3.2.1普通規(guī)定在采血后6小時內(nèi)進(jìn)行離心，室溫下800-1200xg離心10分鐘。3.2.2分離后，吸出血漿，分裝到無菌的聚丙烯螺口凍存管中，并注明分裝時間。在凍存管上貼樣品編號。3.2.3血漿樣品不能滅活。3.2.4做好樣品解決統(tǒng)計。3.3樣品的保存3.3.1保存條件：根據(jù)血漿檢測時間而定，4天內(nèi)可在4℃臨時保存，3個月以內(nèi)應(yīng)凍存于-20℃下列，3個月以上應(yīng)置于-70℃下列。不推薦使用自動除霜冰箱。3.3.2血漿樣品凍融不應(yīng)超出3次。3.3.3監(jiān)控并統(tǒng)計保存溫度以及樣品狀態(tài)的變化。3.3.4避免樣品變質(zhì)、泄漏及污染。3.4樣品的運(yùn)輸根據(jù)《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》的規(guī)定運(yùn)輸，并嚴(yán)格控制運(yùn)輸?shù)睦鋬鰻顟B(tài)，避免樣品凍融。3.5樣品的發(fā)送和接受3.5.1發(fā)送樣品時必須填寫樣品HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接受單（附表2）。3.5.2接受樣品時，核對樣品數(shù)量，檢查樣品狀況，按HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接受單（附表2）核對。3.5.3樣品管破損造成樣品溢出、出現(xiàn)明顯溶血、凝血的樣品，不適宜作HIV-1病毒載量檢測；如果樣品已經(jīng)融化，4℃保存并盡快檢測，統(tǒng)計凍融一次。

第四章慣用HIV-1病毒載量檢測辦法介紹現(xiàn)在慣用的HIVRNA測定辦法為核酸序列依賴性擴(kuò)增(NASBA)技術(shù)，代表產(chǎn)品為NucliSensECL及其升級產(chǎn)品熒光實時PCR技術(shù)NucliSensEasyQ儀；逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)（RT-PCR）技術(shù)，代表產(chǎn)品為AMPLICORHIV-1MONITORassay；分枝DNA信號放大系統(tǒng)（bDNA）技術(shù)，代表產(chǎn)品為bDNA340分析儀；實時熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)（real-timePCR），M與國產(chǎn)試劑盒均屬這類技術(shù)。4．1核酸序列依賴性擴(kuò)增(NASBA)技術(shù)最早產(chǎn)品為NucliSensECL定量RNA測定辦法，近來被NucliSensEasyQ新一代熒光實時定量PCR所取代。NASBA技術(shù)是一種等溫擴(kuò)增系統(tǒng)，其擴(kuò)增基礎(chǔ)在于系統(tǒng)內(nèi)的混合酶系統(tǒng)，此系統(tǒng)內(nèi)含有逆轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶在體外模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)復(fù)制過程。此辦法可分成四個環(huán)節(jié)：核酸釋放、提取、擴(kuò)增和測定。擴(kuò)增后的產(chǎn)物使用NASBAQR電化學(xué)發(fā)光（ECL）系統(tǒng)進(jìn)行檢測和定量，此系統(tǒng)涉及親和素標(biāo)記的磁珠、生物素標(biāo)記的核苷酸片段（此片段可與新合成的RNA產(chǎn)物的一端互補(bǔ)結(jié)合）及可特異與四種產(chǎn)物結(jié)合的探針（探針上標(biāo)記有銣元素），這四種探針可分別與不同的RNA產(chǎn)物結(jié)合。將四種探針分別置于不同的反映管內(nèi)，在適宜的條件下（410C）幾個成分將結(jié)合在一起，形成復(fù)合體。這些復(fù)合體可在ECL讀數(shù)儀中被分別讀取銣元素的激發(fā)信號，根據(jù)野生型病毒核酸測定值與其它三個內(nèi)標(biāo)物測定值的比較可得到野生型病毒的拷貝數(shù)。NuclisensEasyQ結(jié)合NASBA（核酸序列基礎(chǔ)分析）技術(shù)與分子熒光探針技術(shù)（MolecularBeacon）檢測血漿中的HIVRNA水平。這種結(jié)合的辦法使用了實時擴(kuò)增分析（real-timeamplificationassay），提高了對診療質(zhì)量的規(guī)定。4．2逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)技術(shù)現(xiàn)在用得最廣泛的儀器為COBASAMPLICOR和對應(yīng)的檢測試劑COBASAMPLICORHIV-1MONITORTM1.5版。聚合酶鏈反映人類免疫缺點病毒HIV-1定量檢測試劑盒1.5版是在聚合酶鏈反映全自動診療儀上定量測定人血漿中人類免疫缺點病毒I型（HIV-1）RNA水平的體外核酸擴(kuò)增檢測試劑盒。該檢測試劑盒能夠通過兩種樣品解決程序進(jìn)行檢測，即原則的和超敏感的操作環(huán)節(jié)，定量測定含量為50-750,000拷貝/毫升HIV-1RNA。原則的樣品解決程序中，HIV-1RNA通過應(yīng)用裂解液裂解病毒顆粒從而直接從血漿中分離出來，然后用乙醇沉淀RNA。采用超敏感的制備辦法，血漿中HIV-1病毒顆粒首先通過高速離心濃縮，然后用裂解試劑裂解病毒顆粒。再用乙醇沉淀RNA。COBASAMPLICORHIV-1MONITORTM試劑盒1.5版涉及5個重要環(huán)節(jié)：試劑準(zhǔn)備；樣品制備；靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA；用HIV-1特異互補(bǔ)引物進(jìn)行靶cDNAPCR擴(kuò)增；通過比色與探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物的測定。HIV-1病毒RNA的定量檢測是采用HIV-1定量原則品來完畢的。HIV-1定量原則品是涉及作為HIV-1靶RNA引物結(jié)合部位和HIV-1擴(kuò)增子單一探針結(jié)合區(qū)的非感染性RNA轉(zhuǎn)錄物。將已知拷貝數(shù)的HIV-1定量原則品加到每一種樣品中和HIV-1靶序列一起共同進(jìn)行樣品制備、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、雜交和檢測并和HIV-1靶序列一起擴(kuò)增。COBASAMPLICOR分析儀根據(jù)HIV-1定量原則品的數(shù)據(jù)計算每一種樣品的HIV-1RNA的含量。該定量原則品賠償了克制因素的影響并且擴(kuò)增過程的質(zhì)控使每一種樣品的HIV–1RNA得以精擬定量。4．3分枝DNA（bDNA）技術(shù)分枝DNA測定技術(shù)基于其獨特的信號放大系統(tǒng)，即分枝DNA信號放大系統(tǒng)，這是一種人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可結(jié)合多個酶標(biāo)記物，從而將病毒的信號放大，方便進(jìn)行檢測。此檢測系統(tǒng)不涉及核酸擴(kuò)增反映。本辦法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標(biāo)記物，每次實驗設(shè)立一系列外部標(biāo)記，通過實驗樣品反映強(qiáng)度與外部標(biāo)記樣品強(qiáng)度的比較擬定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。每一種bDNA檢測都有各自的環(huán)節(jié)或試劑。bDNA檢測普通涉及下列環(huán)節(jié)：（1）將患者血清或血漿連同含有特異的合成寡聚核苷酸靶探針的裂解液加到微孔中；（2）孵育。此環(huán)節(jié)可釋放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA變性,然后靶探針結(jié)合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷卻洗板；（4）加信號放大探針(bDNA)到各孔內(nèi)；（5）孵育.此環(huán)節(jié)使bDNA雜交到靶探針的對應(yīng)部位；（6）冷卻洗板；（7）加標(biāo)記探針到各孔內(nèi)；（8）孵育，此環(huán)節(jié)使酶標(biāo)記的探針雜交到bDNA上；（9）冷卻洗板；（10）加化學(xué)發(fā)光底物到各孔中；（11）孵育，此環(huán)節(jié)讓酶和底物互相作用，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。發(fā)射的光強(qiáng)以相對光量值(RLUs)表達(dá)。產(chǎn)生的光強(qiáng)直接與各樣品中病毒RNA或DNA的載量成正比。各樣品中病毒核酸的含量由與樣品一同解決的原則所制作的原則曲線計算獲得。4．4實時（real-time）熒光定量PCR擴(kuò)增實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反映體系中加入熒光基團(tuán)，運(yùn)用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過原則曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的辦法。每個反映管內(nèi)的熒光信號達(dá)成設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。運(yùn)用已知起始拷貝數(shù)的原則品可作出原則曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從原則曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR擴(kuò)增的實驗檢測過程可分為：（1）樣品制備,抽提和濃縮目的RNA分子，并除去可能存在的克制因子。（2）Real-timePCR，檢測PCR的產(chǎn)物使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。檢測的原理基于熒光信號增加曲線與循環(huán)數(shù)有關(guān)。（3）RT-PCR反映，病毒RNA運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過DNA聚合酶對特定片段進(jìn)行擴(kuò)增。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，基于檢測閾值的設(shè)定，當(dāng)病毒載量高時，低循環(huán)數(shù)即能檢測到熒光信號，當(dāng)病毒載量低時，高循環(huán)數(shù)時才干檢測到熒光。循環(huán)數(shù)與樣品載量成線性關(guān)系。運(yùn)用原則品制作循環(huán)數(shù)與載量的原則曲線就能對樣品載量進(jìn)行定量檢測。

第五章室內(nèi)質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制是在良好實驗室整體環(huán)境支持下，從樣品接受到發(fā)出報告整個過程每個環(huán)節(jié)的管理過程，涉及：（1）人員；（2）實驗室分區(qū)和環(huán)境；（3）儀器；（4）檢測過程（試劑、操作過程，質(zhì)控品使用）；（5）數(shù)據(jù)。5.1人員HIV-1病毒載量檢測人員分為檢查人、復(fù)核人、簽發(fā)人。5.1.1全部有關(guān)檢查人員需經(jīng)操作培訓(xùn)，能獨立純熟地操作，并經(jīng)考核合格，持證上崗。5.1.2復(fù)核人、簽發(fā)人應(yīng)含有對檢測過程進(jìn)行分析、解決問題的能力。5.2實驗室分區(qū)和環(huán)境5.2.1實驗室分區(qū)的功效HIV-1病毒載量檢測實驗室原則上應(yīng)分為三個獨立工作區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品解決區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，并設(shè)在不同房間。不同檢測辦法的分區(qū)功效和規(guī)定可有所不同。5.2.1.1試劑準(zhǔn)備區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存；5.2.1.2樣品解決區(qū)：樣品登記、分裝，核酸提取、保存和加樣；5.2.1.3擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：產(chǎn)物擴(kuò)增的測定、成果分析、登記及報告。嚴(yán)格規(guī)定三區(qū)的空氣流向：從試劑準(zhǔn)備區(qū)到樣品解決區(qū)，然后到擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不能逆向流動。實驗室的設(shè)立及輔助設(shè)備的具體規(guī)定參見第二章。5.2.2實驗室環(huán)境的規(guī)定5.2.2.1實驗室有足夠的空間；5.2.2.2采光好，應(yīng)避免陽光直射設(shè)備；5.2.2.3室溫控制在18~25℃；5.2.2.4室內(nèi)相對濕度控制在50~70%；5.2.2.5電源穩(wěn)定，HIV-1病毒載量檢測儀應(yīng)配備穩(wěn)壓電源；5.2.2.6室內(nèi)保持干凈整潔，無灰塵。5.2.2.7實驗前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸鈉及時解決操作臺面。5.3儀器設(shè)備質(zhì)控5.3.1加樣器、溫濕度計須經(jīng)計量部門校準(zhǔn)，每年一次。每季度期間核查一次。5.3.2HIV-1病毒載量檢測儀、離心機(jī)能夠委托公司校準(zhǔn)，每年一次。5.3.3冰箱、水浴箱用校準(zhǔn)合格的溫度計測量溫度，并做好統(tǒng)計。5.4檢測過程質(zhì)控5.4.1試劑質(zhì)控5.4.1.1全部試劑盒須嚴(yán)格按規(guī)定條件保存。5.4.1.2試劑盒拆封時，要統(tǒng)計拆封時間，全部試劑嚴(yán)格控制在使用期內(nèi)使用。5.4.1.3使用經(jīng)中國食品藥品監(jiān)督管理局注冊的試劑。5.4.2實驗用水：規(guī)定使用無DNA和RNA酶的水。5.4.3操作過程質(zhì)控嚴(yán)格執(zhí)行儀器和試劑的原則操作程序（SOP），不得私自修改。5.4.4質(zhì)控品的使用每次實驗需同時使用試劑盒內(nèi)的質(zhì)控品以及一種HIV-1RNA為5000-15000拷貝/毫升的外部質(zhì)控品。5.4.4.1外部質(zhì)控品的制備按實際使用量的規(guī)定配制大樣品量的血漿（推薦每次配備量可使用兩年），用0.2μm濾膜過濾除菌，充足混勻。用無菌凍存管定量分裝，標(biāo)記，封口，凍存于-80℃下列非自動除霜冰箱內(nèi)。5.4.4.2外部質(zhì)控品的定值隨機(jī)選出10管外部質(zhì)控品，按照實驗室的檢測條件進(jìn)行HIV-1病毒載量檢測，將拷貝值換算成Log10值，計算算術(shù)平均值（m）和原則偏差（s）。5.4.4.3質(zhì)控圖的繪制和使用根據(jù)外部質(zhì)控品的定值，繪制質(zhì)控圖。在質(zhì)控圖上顯示全部10次質(zhì)控品檢測值的Log10值、平均值以及1.5s值范疇。每次檢測都應(yīng)帶1個外部對照，將得到的外部對照Log10值標(biāo)在質(zhì)控圖上，根據(jù)與否在1.5s值范疇判斷實驗成果與否有效，每次測得值在平均值±1.5S內(nèi)方為有效。使用新批次的外部對照質(zhì)控品時，必須重新繪制質(zhì)控圖。5.4.5試劑盒質(zhì)控品的使用每次實驗按照試劑盒闡明書的規(guī)定使用試劑盒提供的質(zhì)控品，并滿足質(zhì)控品的規(guī)定。5.5數(shù)據(jù)分析、成果報告5.5.1在試劑盒及外部質(zhì)控品成果滿足規(guī)定的前提下，對樣品進(jìn)行分析。5.5.2外部質(zhì)控品不合格，樣品需要重新檢測。5.5.3成果超出檢測上限的樣品應(yīng)稀釋后來重新檢測。5.5.4復(fù)核人對檢測成果進(jìn)行認(rèn)真復(fù)核并對成果提出結(jié)論、簽字。5.5.5簽發(fā)人對成果的結(jié)論進(jìn)行審核、分析、總結(jié)、簽字。5.5.6按不同辦法的規(guī)定，以拷貝/毫升或國際單位/毫升為單位報告樣品的HIV-1病毒載量值。

第六章外部質(zhì)量控制HIV-1病毒載量檢測的外部質(zhì)量控制能夠通過參加外部質(zhì)量評價，提高實驗成果的可比性，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差，改善實驗室工作，提高檢測質(zhì)量。艾滋病參比實驗室自開始參加由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）組織的HIV-1病毒載量檢測考核工作，考核盤有5個樣品構(gòu)成，分別考核算驗室檢測的敏捷度、特異性、穩(wěn)定性和精確性，通過將成果與國際上參加考核的全部實驗室成果進(jìn)行比對評定，給出綜合評定成果。通過參加考核，確保艾滋病參比實驗室的不同HIV-1病毒載量檢測系統(tǒng)的有效性?，F(xiàn)在，艾滋病檢測實驗室通過參加艾滋病參比實驗室組織的HIV-1病毒載量檢測能力驗證來實施外部質(zhì)量控制。6.1HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的組織艾滋病參比實驗室為HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的組織者，負(fù)責(zé)制訂國內(nèi)HIV-1病毒載量檢測能力驗證的計劃并組織實施。建議國內(nèi)全部從事HIV-1病毒載量檢測的實驗室參加該P(yáng)T項目，在規(guī)定時間內(nèi)使用有效試劑與實驗樣品一起檢測，填寫HIV-1病毒載量實驗成果報告單（附表4-6），上報艾滋病參比實驗室。激勵有條件的實驗室參加國際組織的PT活動。6.2HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的實施6.2.1PT樣品構(gòu)成：每次5份。涉及陰性、不同拷貝數(shù)的陽性樣品。6.2.2PT頻率：一年2次，分別為3月和9月。6.2.3PT樣品的接受與保存：規(guī)定參加PT的實驗室收到考核樣品后，立刻進(jìn)行核對、檢查，填寫HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接受專用單（附表3），3天內(nèi)將接受專用單傳回艾滋病參比實驗室。如發(fā)現(xiàn)考核樣品缺失、量局限性、空管等狀況，及時書面回報，艾滋病參比實驗室負(fù)責(zé)補(bǔ)寄或更換。收到樣品后應(yīng)及時檢測或在-70度下列保存。6.2.4PT樣品的檢測：規(guī)定將考核樣品同實驗室常規(guī)樣品一起檢測，由常規(guī)檢測人員進(jìn)行，不應(yīng)作為特殊樣品解決。6.2.5PT成果的報告和解決：參加PT的實驗室必須在規(guī)定的時間內(nèi)（收到樣品3個月內(nèi)），用電子郵件報告實驗成果，并將HIV-1病毒載量實驗成果報告單（附表4-6）和打印的儀器原始統(tǒng)計一起上報給艾滋病參比實驗室，后者將負(fù)責(zé)成果錄入和解決。6.2.6評分原則：沒有任何問題者為優(yōu)秀；出現(xiàn)6.2.6.1中的一條為良好；出現(xiàn)最少6.2.6.1中的兩條或最少6.2.6.2中的一條為不合格。6.2.6.1次要問題：一種樣品成果在±1.5~2.0S內(nèi)；一種假陽性；一種無效成果；一種抄寫錯誤。6.2.6.2重要問題：兩個樣品成果超出±2.0S；兩個及以上假陽性；兩個及以上無效成果；兩個及以上抄寫錯誤。6.2.7評定成果反饋：艾滋病參比實驗室根據(jù)各實驗室的兩次考核成果，每年反饋最后的評定成果。6.2.8埋怨和申訴：參評實驗室如對評定成果或其它方面存有異議，能夠在收到成果后10天內(nèi)向艾滋病參比實驗室提出異議，后者在核算狀況后予以回復(fù)。6.2.9現(xiàn)場督導(dǎo)：根據(jù)考核狀況的需要，艾滋病參比實驗室構(gòu)成技術(shù)專家組對不合格實驗室進(jìn)行現(xiàn)場檢查。檢查內(nèi)容涉及：實驗原始數(shù)據(jù)、實驗室布局、儀器運(yùn)行狀況、輔助設(shè)備校準(zhǔn)狀況、實驗耗材質(zhì)量、樣品保存、試劑盒使用狀態(tài)、人員培訓(xùn)狀況、質(zhì)量確保和質(zhì)量控制等。

第七章實驗室生物安全7.1有關(guān)根據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《實驗室生物安全通用規(guī)定》、《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣品運(yùn)輸管理規(guī)定》、《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗活動生物安全審批管理方法》和《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》。7.2安全細(xì)則7.2.1進(jìn)入實驗室應(yīng)穿工作服、戴口罩、戴一次性乳膠手套。嚴(yán)禁在實驗室內(nèi)進(jìn)食、飲水和吸煙以及使用化妝品。7.2.2全部樣品涉及試劑盒中的人源性成分（如陰、陽性對照）都應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行解決。7.2.3樣品應(yīng)盛裝在有螺旋蓋的管子中，以防樣品濺出或產(chǎn)生交叉污染。當(dāng)含有潛在傳染性的物質(zhì)溢出時，立刻用0.1%次氯酸鈉溶液或其它消毒劑解決污染區(qū)及器材；接觸過標(biāo)本的器材應(yīng)置有專用消毒劑的容器，與一次性物品一起在丟棄邁進(jìn)行高壓滅菌解決。7.2.4避免試劑盒中多個有毒有害化學(xué)成分（如疊氮鈉、二甲基亞砜、異硫氰酸胍）對人體或環(huán)境可能造成的危害。7.3生物安全培訓(xùn)7.3.1全部涉及HIV-1病毒載量檢測的人員都應(yīng)通過嚴(yán)格的技術(shù)培訓(xùn)，要掌握生物安全保障的原則、方法。每個人的安全教育均應(yīng)統(tǒng)計在實驗室和人事檔案中。7.3.2省級及以上疾控中心艾滋病實驗室負(fù)責(zé)HIV/AIDS檢測生物安全培訓(xùn)及HIV-1病毒載量檢測培訓(xùn)。7.3.3檢測有關(guān)人員應(yīng)主動接受實驗室生物安全員以及安全負(fù)責(zé)人的監(jiān)督。全部實驗室意外事件均應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計和報告。7.3.4全部人員要保護(hù)本身和環(huán)境的安全。7.3.5參考實驗室安全指南和原則操作程序的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行具體操作。7.4職業(yè)暴露解決7.4.1實驗室應(yīng)建立完善的艾滋病職業(yè)暴露后的防止機(jī)制。7.4.2發(fā)生職業(yè)暴露后，首先進(jìn)行應(yīng)急解決，然后根據(jù)暴露級別和暴露源頭嚴(yán)重程度，評定風(fēng)險級別，并決定與否進(jìn)行防止性用藥和用藥程序，如需要時，盡早開始服用抗病毒藥品。7.4.3按規(guī)定進(jìn)行職業(yè)暴露登記、檢測和報告，注意做好保密工作。

附表1常見問題分析（一）NASBA問題因素解決辦法血清或血漿樣品中有特殊物質(zhì)化凍緩慢引發(fā)的細(xì)胞裂解離心至上清清亮硅膠難以重新懸浮樣品中核酸水平太高激烈震蕩混懸，由于洗滌/洗脫效率不高可影響敏感度。樣品最多帶有相稱于106個細(xì)胞的DNA。硅膠干燥不佳丙酮剩余太多用100-1000μl槍頭吸干凈干燥溫度太低干燥時間最多延長2分鐘檢查加熱模塊的溫度加入硅膠的樣品離心后難以溶解硅膠孵育時間太長(>12min)增加震蕩時間和強(qiáng)度無效成果；信號太低酶未完全溶解確保酶稀釋和使用前平衡至室溫，充足溶解并在一小時內(nèi)使用磁珠未充足混勻或加入的量太少每次加入前先震蕩混勻，確保磁珠快速沉在管底樣品濃度太高檢查檢測稀釋液、樣品及已稀釋樣品加入的量擴(kuò)增時溫度偏差調(diào)節(jié)加熱溫度，應(yīng)當(dāng)在41±0.5°C.（二）RT-PCR問題因素解決辦法QS_無效（QS_INVALID）QS稀釋系列的A660數(shù)值未在檢測的吸光度范疇內(nèi)。該樣品檢測的成果無效。成果無效的樣品應(yīng)從樣品和質(zhì)控的制備開始重新進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和檢測。靶序列吸光度偏低(TARGETODLO)全部HIV-1的稀釋度的A660數(shù)值低于檢測的線性范疇。報告成果根據(jù)所采用的原則的或極度敏感的提取辦法能夠是“HIV-1RNA沒有檢測到（HIV-1RNA低于400拷貝/毫升）”或“HIV-1RNA沒有檢測到（低于50拷貝/毫升）”。靶序列吸光度偏高(TARGETODHI)全部HIV-1的稀釋度的A660數(shù)值高于檢測的線性范疇。報告成果形式為“不能擬定”。（1）如果采用原則樣品解決程序，用HIV陰性的人血漿稀釋原始樣品并用原則的樣品解決程序重新檢測。報告的成果應(yīng)乘以稀釋因子。（2）如果采用極度敏感的樣品解決程序，稀釋原始血漿樣品，用原則的樣品解決程序重新檢測。報告的成果應(yīng)乘以稀釋因子。成果偏低（RESULT_LO）計算的拷貝數(shù)低于測定下限。對于原則的樣品解決程序，成果能夠報告為“檢測到HIV-1RNA,含量低于400拷貝/毫升”。如果需要定量的成果，原始樣品應(yīng)當(dāng)使用極度敏感的樣品解決程序重新檢測。對于極度敏感的樣品解決程序，能夠報告為“檢測到HIV-1RNA,含量低于50拷貝/毫升”。成果偏高（RESULT_HI）計算的拷貝數(shù)高于測定上限。對于原則的樣品解決程序，成果能夠報告為“HIV-1RNA含量高于7.5105拷貝/毫升”。如果需要定量的成果，原始樣品能夠用HIV-1陰性的人血漿稀釋并重新檢測。報告的成果應(yīng)乘以稀釋因子。對于極度敏感的樣品解決程序，重新檢測。對于極度敏感的樣品解決程序，成果能夠報告為“HIV-1RNA含量高于1.0105拷貝/毫升”。如果需要定量的成果，稀釋原始樣品用原則的樣品解決程序重新檢測。TARG_GANGE全部靶模板的A660數(shù)值都不在線性測定范疇之內(nèi)。能夠報告為“未檢出?！敝匦聶z測原始樣品，重復(fù)樣品和質(zhì)控制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和檢測環(huán)節(jié)。OD_SEQUENCE提示有不合乎稀釋次序的A660值出現(xiàn)。重復(fù)整個實驗環(huán)節(jié)涉及樣品和質(zhì)控的制備、擴(kuò)增和檢測。QS_SEQUENCE提示QS有不合乎稀釋次序的A660值出現(xiàn)。重復(fù)整個實驗環(huán)節(jié)涉及樣品和質(zhì)控的制備、擴(kuò)增和檢測。（三）EasyQ問題因素解決辦法分子信標(biāo)沒有檢測絕對信號水平太低用洗脫液重新檢測Q值設(shè)定（<q大小>）的大小不同于WT值設(shè)定（<WT大小>）的大小內(nèi)參考數(shù)據(jù)設(shè)定的大小不同于WT數(shù)據(jù)設(shè)定的大小重新設(shè)定內(nèi)參考數(shù)據(jù)測定的曲線不持續(xù)所測定曲線不持續(xù)性用洗脫液重新檢測沒有擴(kuò)增內(nèi)參考和WT最大/最小信號的比值都低于閾值用洗脫液或者樣品再開始測擴(kuò)增弱曲線斜率太低用洗脫液重新檢測計算錯誤曲線擬合程序產(chǎn)生錯誤用洗脫液重新檢測不對的的擴(kuò)增動力學(xué)擬合曲線沒有對的地描述所觀察的數(shù)據(jù)用洗脫液重新檢測延遲時間太短起始熒光增加的速度太快用洗脫液重新檢測。確信加入酶和開始此輪運(yùn)行之間的時間少于8分鐘。擴(kuò)增弱內(nèi)參考值和WT值都沒有達(dá)成一種平臺值用洗脫液重新檢測沒有測到內(nèi)參考。沒加內(nèi)參考或者樣品的加入水平太高沒有測到內(nèi)參考的信號，可能是由于在核酸的分離物中沒有加內(nèi)參考或者WT的加入太高用（稀釋過的）樣品重新檢測（四）bDNA問題因素解決辦法注射器含有氣泡洗液瓶,水瓶,漂白液瓶是空的或管道連接松弛。加適量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶內(nèi)液面下。分析儀底部的加熱托盤上有液體管路連接松弛或一洗頭的分液或吸液針管堵塞。檢查管路連接。管路有堵塞或細(xì)菌滋生管路和試劑瓶沒有對的保養(yǎng)。每次實驗后清洗并晾干洗液瓶和水瓶，倒空廢液瓶；每七天清洗洗液瓶,水瓶和廢液瓶，管路系統(tǒng)。分析儀不能從孔內(nèi)吸取足夠的液體洗頭中有堵塞,洗頭針頭彎曲,廢液管連接松弛,吸液泵損壞。檢查廢液管連接頭RLU值低試劑遺漏,用錯試劑,某種試劑配制錯誤,漂白液污染,孵育時間或溫度不對的,或檢測板冷卻局限性。在實驗前擬定盛水試劑瓶已滿。擬定按產(chǎn)品規(guī)定儲存、配制試劑；環(huán)境溫度在18-30℃；試劑盒沒有過期；實驗中所使用的試劑來自同一批次；每七天清洗過程中在管道和試劑瓶中沒有殘留。RLU值高實驗被污染,清洗不充足,或有光泄露。擬定全使用干凈的一次性無菌實驗材料；使用防氣溶膠的加樣槍頭；殘留的底物沒有倒回原瓶；用70%乙醇定時擦洗微量加樣器；盛洗液的試劑瓶內(nèi)有足夠量的洗液；檢查分液、吸液操作；每七天進(jìn)行保養(yǎng)；分析倉門關(guān)閉嚴(yán)實；檢查背景RLU值。變異系數(shù)(CV)高移液操作錯誤,樣品質(zhì)量差,孔有污染,清洗不充足,試劑沒有預(yù)熱充足,試劑沒有充足混勻,孔內(nèi)樣液蒸發(fā),孔內(nèi)樣液濺灑,有光漏。擬定微量加樣器經(jīng)校準(zhǔn)；使用防氣溶膠的槍頭；槍頭緊密套在加樣器上；加試劑時槍頭位置在孔的中部；樣品凝塊或殘渣沒有被吸?。粯悠芳拥奈恢门c樣品ID和DMS規(guī)定的位置一致；樣品按產(chǎn)品闡明收集,解決和儲存；只使用干凈的一次性無菌實驗材料；檢查分液吸液操作；盛洗液的試劑瓶內(nèi)已裝有足夠量的洗液；每種試劑在實驗開始前被輕輕混勻；每種試劑預(yù)熱充足,以防有沉淀；封閉墊組裝對的；孔內(nèi)樣液沒有濺灑；分析倉門關(guān)閉嚴(yán)實；檢查RLU背景。原則曲線平坦或不正常加原則時板的缺口在右邊,或原則加入次序有誤。加原則時板的缺口在左邊強(qiáng)或弱對照定量高強(qiáng)陽性對照受污染,吸取誤差,或原則曲線有問題。擬定各孔認(rèn)真加樣,未觸及鄰孔；使用無菌槍頭；封閉墊組裝無誤；加樣器定時校準(zhǔn)；使用防氣溶膠的槍頭；原則和對照加樣位置對的；按產(chǎn)品闡明規(guī)定儲存,配制。強(qiáng)或弱對照定量低對照降解,對照濺灑,對照孔液蒸發(fā),對照加樣有誤,或?qū)φ諞]有充足混勻。擬定試劑盒在運(yùn)輸和到貨后儲存在對的的溫度；使用無菌槍頭；沒有吸取氣泡；封閉墊組裝無誤；加樣器經(jīng)校準(zhǔn)；小心解決測試板,避免濺灑；原則和對照加樣位置對的；按產(chǎn)品闡明規(guī)定儲存,配制；樣品,原則,對照在吸取前最少震蕩5秒。

附表2HIV-1病毒載量檢測樣品送檢/接受單送檢單位送檢日期接受單位接受時間采樣時間采樣管抗凝劑樣品保存溫度樣品運(yùn)輸條件姓名性別年紀(jì)職業(yè)國籍或民族戶籍所在地既往病史使用藥品抗HIV病毒藥品樣品編號樣品性質(zhì)樣品量（ml）備注送樣人接受人

附表3HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接受專用單實驗室名稱接受日期收到樣品量編號體積（ul）樣品狀態(tài)外包裝與否完整是否冰塊與否融化是否樣品與否融化是否計劃檢測日期檢測辦法接受樣品后寄存溫度4℃-20℃-80℃其它接受人實驗室負(fù)責(zé)人填表日期：

附表4HIV-1病毒載量檢測報告單送檢單位姓名性別年齡國籍或民族職業(yè)戶籍所在地送檢日期送檢樣品編號HIV-1病毒載量（copies/ml）檢測人簽發(fā)人報告日期年月日復(fù)核人檢測單位或?qū)嶒炇遥ü拢﹤渥?、檢測辦法：2、檢測限：附表5HIV-1病毒載量能力驗證成果專用報告單（NASBA)病毒載量實驗成果報告單（NASBA)樣品準(zhǔn)備試劑批號