復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者潰瘍期和間隙期的egf質(zhì)量濃度變化及病損區(qū)表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)缺陷

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者潰瘍期和間隙期的egf質(zhì)量濃度變化及病損區(qū)表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)缺陷

復(fù)發(fā)性阿托爾潰瘍（rau）是一種常見(jiàn)的口腔疾病，但病因不明，治療效果差。無(wú)論何種致病因素,最終都導(dǎo)致口腔黏膜上皮局部完整性喪失及潰瘍面緩慢修復(fù)(比正常人口腔黏膜創(chuàng)傷后潰瘍的自愈速度慢),并且這種情形交替進(jìn)行?？谇火つど掀さ耐暾允茉S多因素的影響,本研究從表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor,EGF)及其受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)著手,分析RAU患者口腔黏膜上皮修復(fù)過(guò)程中的異常現(xiàn)象。唾液中EGF主要來(lái)源于頜下腺和腮腺,可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和趨化。EGFR分布于基底細(xì)胞層,其余上皮層表達(dá)陰性。EGF與EGFR結(jié)合后對(duì)細(xì)胞的作用表現(xiàn)為:1)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、分化和遷移;2)促進(jìn)血管生成;3)增加物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與糖代謝;4)增加前列腺素的合成與釋放。本研究的目的是探討RAU患者潰瘍期和間隙期的唾液EGF質(zhì)量濃度的變化,以及潰瘍病損區(qū)EGFR的表達(dá)是否有缺陷。1材料和方法1.1病例選擇及要求RAU1組(唾液組):選擇2000年7月—2001年6月在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院黏膜病科確診的輕型RAU患者30例為病變組;其中27例在潰瘍愈合后復(fù)診。27例患者中男性14例,女性13例;年齡為27~46歲,平均35歲。對(duì)照1組:同期在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院工作人員及就診患者家屬中選擇健康自愿者33例,男性15例,女性18例;年齡23~52歲,平均38歲。RAU2組(組織活檢組):選擇2001年7月—2001年10月在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院黏膜病科確診的輕型RAU患者31例為病變組,其中男性19例,女性12例;年齡32~48歲,平均36歲。對(duì)照2組:同期于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院選擇在門診就診的因拔牙或門診小手術(shù)患者35例,其中男性21例,女性14例;年齡22~37歲,平均34歲。RAU1組和2組均要求臨床確診為輕型RAU,病變狀況沒(méi)有明顯差別,口腔中出現(xiàn)潰瘍不超過(guò)4d,未使用全身藥物及局部藥物;對(duì)照1組和2組要求無(wú)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病史。4組研究對(duì)象均要求無(wú)糖尿病、尿毒癥、甲狀腺功能亢進(jìn)、急慢性涎腺炎或涎腺結(jié)石、牙周病、干燥綜合征等疾病,無(wú)其他口腔黏膜病,無(wú)頭頸部放療史,未使用過(guò)交感神經(jīng)抑制藥物和皮質(zhì)激素等藥物治療。1.2樣本采集1.2.1次給藥,避免痰液污染采用靜態(tài)吸引法采集RAU1組和對(duì)照1組唾液,于上午9—10時(shí)在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院黏膜病科進(jìn)行。受試者取坐位,頭端正,不要有吞咽動(dòng)作,讓唾液自然蓄積于口底,防止痰液污染。用一次性空針抽取1mL唾液裝入已消毒的EP管,于-20℃冰箱中保存。1.2.2采用皮組織RAU2組在經(jīng)患者及家屬同意后,在潰瘍基底用質(zhì)量濃度2%利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉,于潰瘍邊緣用眼科剪剪取約0.1cm×0.2cm上皮組織,塑料袋密封編號(hào),放入液氮中保存?zhèn)溆谩?duì)照2組同樣在經(jīng)患者及家屬同意后,在拔牙或手術(shù)時(shí)剪取0.1cm×0.2cm正常黏膜上皮組織,塑料袋密封編號(hào),放入液氮中保存?zhèn)溆谩?.3egfr-rna表達(dá)RAU1組患者確診后(潰瘍期)先采集唾液樣本,于間隙期復(fù)診時(shí)再次采集唾液樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)RAU1組和對(duì)照1組唾液樣本中EGF質(zhì)量濃度。采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescentquantitationreversetranscriptionpolymerasechainreac-tion,FQ-RT-PCR)檢測(cè)RAU2組和對(duì)照2組組織樣本中EGFR-RNA的表達(dá)情況。所有試驗(yàn)在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院黏膜實(shí)驗(yàn)室與華西醫(yī)學(xué)院基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.3.1熒光高效分析1)主要儀器與試劑:EGFELISA試劑盒,內(nèi)含標(biāo)準(zhǔn)EGF液、多克隆抗體、染色液、終止液、酶等(Chemicon公司,美國(guó));微量反應(yīng)板(R﹠D公司,美國(guó));HTS700型紫外熒光高效分析儀(PE公司,美國(guó))。2)檢測(cè)方法:將標(biāo)準(zhǔn)EGF液與未知EGF質(zhì)量濃度的唾液標(biāo)本分別與兔抗人EGF多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,加入酶標(biāo)底物,出現(xiàn)顏色反應(yīng)。測(cè)出所有標(biāo)本的光密度(op-ticaldensity,OD)值,由標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度的EGF與其OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,因?yàn)轭伾纳顪\與EGF質(zhì)量濃度成正比,所以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)出唾液標(biāo)本的EGF質(zhì)量濃度。1.3.2檢測(cè)儀器和方法1)實(shí)驗(yàn)流程:常規(guī)提取活檢組織塊的總RNA,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定組織塊總RNA質(zhì)量濃度為80μg/mL,然后通過(guò)EGFR-RNA的引物熒光標(biāo)記進(jìn)行FQ-RT-PCR分析,測(cè)定組織塊總RNA中EGFR-RNA的相對(duì)含量(拷貝數(shù))。2)主要儀器及試劑:小量組織/細(xì)胞總RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司);RT-PCR試劑盒(Roche公司,美國(guó));紫外熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);94型電泳儀(Bio-Rad公司,美國(guó));FQ-RT-PCR儀(Roche公司,美國(guó))。3)引物設(shè)計(jì):EGFR-RNA的PCR特異性引物設(shè)計(jì)參見(jiàn)參考文獻(xiàn),由成都天泰公司提供。F-Primer113120bp和R-Primer113820bp;5′端引物序列為5′-CTA-TGAGATGGAGGAAGACG-3′,3′端引物序列為5′-CAGAGGAGGAGTATGTGTGA-3′。4)循環(huán)程序設(shè)定:首先55℃孵育10min,95℃30s;然后變性95℃6s,退火55℃10s,延伸72℃15s,共45個(gè)循環(huán)。再孵育40℃30s,95℃10s,65℃10s,95℃10s。擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)熒光顯示強(qiáng)度,與FQ-RT-PCR儀電腦設(shè)定的最大信號(hào)進(jìn)行對(duì)照,用該設(shè)備的電腦軟件計(jì)算待測(cè)標(biāo)本EGFR-RNA的相對(duì)含量(拷貝數(shù))。5)陰性對(duì)照為反應(yīng)體系不加cDNA模板。1.4統(tǒng)計(jì)分析采用SPPS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),三組間比較采用方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。2egf質(zhì)量濃度與性別、年齡的關(guān)系RAU1組潰瘍期、間隙期和對(duì)照1組唾液EGF質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),RAU1組潰瘍期患者唾液EGF質(zhì)量濃度高于間隙期和對(duì)照1組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3.24,P<0.05);而RAU1組間隙期唾液EGF質(zhì)量濃度低于對(duì)照1組(t=2.73,P<0.05)。在EGF質(zhì)量濃度與性別的關(guān)系上,RAU1組潰瘍期和間隙期男性與女性的唾液EGF質(zhì)量濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);對(duì)照1組男性與女性的唾液EGF質(zhì)量濃度也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在EGF質(zhì)量濃度與年齡的關(guān)系上,RAU1組和對(duì)照1組唾液EGF質(zhì)量濃度與年齡均無(wú)相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為r=0.03,P=0.33;r=0.02,P=0.11。RAU2組與對(duì)照2組的EGFR檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。圖1顯示RAU2組起始模板量高,拷貝數(shù)大;圖2表明RAU2組峰值高,起始模板量大。RAU2組EGFR-RNA的相對(duì)平均含量為3.097,對(duì)照2組為1.965,兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.15,P<0.05),RAU2組EGFR-RNA表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照2組。3帶血管人口pb:rau患者間隙期濾液egf質(zhì)量濃度與口腔復(fù)發(fā)性的關(guān)系本研究結(jié)果表明,RAU1組潰瘍期患者唾液EGF質(zhì)量濃度高于對(duì)照1組(P<0.05),可能是人體對(duì)潰瘍存在時(shí)的應(yīng)答反應(yīng),這與RAU能自愈但比正常黏膜受創(chuàng)傷后自愈速度慢的現(xiàn)象相吻合。Wright等認(rèn)為,消化道任何潰瘍形成后都能誘導(dǎo)干細(xì)胞形成新的EGF分泌體系,分泌大量的EGF,刺激細(xì)胞增殖、再生,促進(jìn)潰瘍愈合。RAU患者出現(xiàn)潰瘍后,可能在一些炎性介質(zhì)刺激或者不明因素作用下引起神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)反應(yīng),促使頜下腺及其他腺體大量分泌EGF,但在什么環(huán)節(jié)上推動(dòng)RAU的愈合尚未明確。RAU1組間隙期患者唾液EGF質(zhì)量濃度低于對(duì)照1組,筆者推測(cè)RAU的發(fā)生與唾液EGF質(zhì)量濃度降低有關(guān),與其他學(xué)者關(guān)于胃潰瘍與體液EGF質(zhì)量濃度相關(guān)的結(jié)論類似。唾液中EGF對(duì)胃黏膜有保護(hù)作用,頜下腺摘除后胃腔內(nèi)的EGF減少,雖然不會(huì)發(fā)生自發(fā)性潰瘍,但黏膜對(duì)損傷的敏感性增加,容易遭受攻擊因子的破壞而形成潰瘍;胃腔內(nèi)給予外源性EGF后,可預(yù)防實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的發(fā)生或者促進(jìn)胃潰瘍的愈合。胃潰瘍患者在潰瘍活動(dòng)期間,唾液中EGF質(zhì)量濃度明顯低下,胃液中EGF質(zhì)量濃度也較慢性胃炎患者明顯降低,提示唾液EGF質(zhì)量濃度低下可能是消化性潰瘍患者易感性增加的原因之一。對(duì)RAU患者進(jìn)行胃鏡檢查,發(fā)現(xiàn)胃、十二指腸存在與口腔潰瘍相似的散在小潰瘍;也有報(bào)道RAU患者發(fā)病前有口干、唾液量減少的癥狀。唾液中EGF主要來(lái)源于腮腺與頜下腺,頭頸部腫瘤放療后患者口腔黏膜容易出現(xiàn)口腔潰瘍,可能與唾液減少或者EGF減少有關(guān)。從口腔黏膜上皮細(xì)胞層的生長(zhǎng)趨向來(lái)看,口腔黏膜上皮層次的穩(wěn)定性取決于基底細(xì)胞層增殖分化的速度與角化細(xì)胞層脫落的速度相等,當(dāng)前者變慢和/或后者變快時(shí)都會(huì)導(dǎo)致口腔黏膜上皮變薄,抵抗力降低,易于發(fā)生潰瘍。唾液EGF質(zhì)量濃度升高時(shí),黏膜修復(fù)能力加快;降低時(shí)基底細(xì)胞層增殖分化的速度變慢,潰瘍愈合減慢。本研究結(jié)果顯示RAU患者間隙期唾液EGF質(zhì)量濃度低于正常人,這提示EGF與口腔潰瘍復(fù)發(fā)性之間存在相關(guān)性,但是RAU患者病程長(zhǎng)短是否與唾液中EGF質(zhì)量濃度高低有關(guān),尚待進(jìn)一步研究。由于影響口腔黏膜上皮生長(zhǎng)的因素很多,除EGF外,還有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子b、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、表皮內(nèi)五肽等,因此還需深入探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RAU患者間隙期唾液EGF質(zhì)量濃度雖然低于正常人,但在臨床實(shí)踐中恰當(dāng)使用免疫調(diào)節(jié)劑、免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑均能有效減少RAU的發(fā)作頻率,那么免疫系統(tǒng)是否也參與了EGF的生成呢?雖然有關(guān)EGF生成的具體機(jī)制還不明確,但是目前可以肯定的是巨噬細(xì)胞及其他淋巴細(xì)胞和角化細(xì)胞都可以內(nèi)分泌EGF,并與頜下腺和腮腺外分泌EGF并行不悖。另外EGF也可以影響人類白細(xì)胞抗原Ⅱ的表達(dá),后者的表達(dá)紊亂與免疫失控有關(guān)。筆者推測(cè),免疫制劑可雙向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性,可能使EGF的內(nèi)分泌達(dá)到恰當(dāng)?shù)乃?彌補(bǔ)了唾液EGF的不足,間接縮短了RAU病程和減少潰瘍的復(fù)發(fā)?？谇恢蠩GFR存在于黏膜上皮和黏膜下結(jié)締組織中。目前認(rèn)為,一種生長(zhǎng)因子可以對(duì)應(yīng)一種或者多種受體,一種受體也可以對(duì)應(yīng)一種或多種生長(zhǎng)因子,相互間有不同的親和力和選擇性。目前有關(guān)這方面的研究雖然很多,但具體機(jī)制仍不明朗。有學(xué)者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),EGFR在消化道潰瘍愈合期上皮細(xì)胞中的表達(dá)高