復發(fā)性阿弗他潰瘍患者潰瘍期和間隙期的egf質(zhì)量濃度變化及病損區(qū)表皮生長因子受體表達缺陷

復發(fā)性阿弗他潰瘍患者潰瘍期和間隙期的egf質(zhì)量濃度變化及病損區(qū)表皮生長因子受體表達缺陷

復發(fā)性阿托爾潰瘍（rau）是一種常見的口腔疾病，但病因不明，治療效果差。無論何種致病因素,最終都導致口腔黏膜上皮局部完整性喪失及潰瘍面緩慢修復(比正常人口腔黏膜創(chuàng)傷后潰瘍的自愈速度慢),并且這種情形交替進行?？谇火つど掀さ耐暾允茉S多因素的影響,本研究從表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)及其受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)著手,分析RAU患者口腔黏膜上皮修復過程中的異?，F(xiàn)象。唾液中EGF主要來源于頜下腺和腮腺,可促進細胞的生長和趨化。EGFR分布于基底細胞層,其余上皮層表達陰性。EGF與EGFR結合后對細胞的作用表現(xiàn)為:1)促進上皮細胞增殖、分化和遷移;2)促進血管生成;3)增加物質(zhì)的轉(zhuǎn)運與糖代謝;4)增加前列腺素的合成與釋放。本研究的目的是探討RAU患者潰瘍期和間隙期的唾液EGF質(zhì)量濃度的變化,以及潰瘍病損區(qū)EGFR的表達是否有缺陷。1材料和方法1.1病例選擇及要求RAU1組(唾液組):選擇2000年7月—2001年6月在四川大學華西口腔醫(yī)院黏膜病科確診的輕型RAU患者30例為病變組;其中27例在潰瘍愈合后復診。27例患者中男性14例,女性13例;年齡為27~46歲,平均35歲。對照1組:同期在四川大學華西口腔醫(yī)院工作人員及就診患者家屬中選擇健康自愿者33例,男性15例,女性18例;年齡23~52歲,平均38歲。RAU2組(組織活檢組):選擇2001年7月—2001年10月在四川大學華西口腔醫(yī)院黏膜病科確診的輕型RAU患者31例為病變組,其中男性19例,女性12例;年齡32~48歲,平均36歲。對照2組:同期于四川大學華西口腔醫(yī)院選擇在門診就診的因拔牙或門診小手術患者35例,其中男性21例,女性14例;年齡22~37歲,平均34歲。RAU1組和2組均要求臨床確診為輕型RAU,病變狀況沒有明顯差別,口腔中出現(xiàn)潰瘍不超過4d,未使用全身藥物及局部藥物;對照1組和2組要求無復發(fā)性口腔潰瘍病史。4組研究對象均要求無糖尿病、尿毒癥、甲狀腺功能亢進、急慢性涎腺炎或涎腺結石、牙周病、干燥綜合征等疾病,無其他口腔黏膜病,無頭頸部放療史,未使用過交感神經(jīng)抑制藥物和皮質(zhì)激素等藥物治療。1.2樣本采集1.2.1次給藥,避免痰液污染采用靜態(tài)吸引法采集RAU1組和對照1組唾液,于上午9—10時在四川大學華西口腔醫(yī)院黏膜病科進行。受試者取坐位,頭端正,不要有吞咽動作,讓唾液自然蓄積于口底,防止痰液污染。用一次性空針抽取1mL唾液裝入已消毒的EP管,于-20℃冰箱中保存。1.2.2采用皮組織RAU2組在經(jīng)患者及家屬同意后,在潰瘍基底用質(zhì)量濃度2%利多卡因局部浸潤麻醉,于潰瘍邊緣用眼科剪剪取約0.1cm×0.2cm上皮組織,塑料袋密封編號,放入液氮中保存?zhèn)溆?。對?組同樣在經(jīng)患者及家屬同意后,在拔牙或手術時剪取0.1cm×0.2cm正常黏膜上皮組織,塑料袋密封編號,放入液氮中保存?zhèn)溆谩?.3egfr-rna表達RAU1組患者確診后(潰瘍期)先采集唾液樣本,于間隙期復診時再次采集唾液樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測RAU1組和對照1組唾液樣本中EGF質(zhì)量濃度。采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(fluorescentquantitationreversetranscriptionpolymerasechainreac-tion,FQ-RT-PCR)檢測RAU2組和對照2組組織樣本中EGFR-RNA的表達情況。所有試驗在四川大學華西口腔醫(yī)學院黏膜實驗室與華西醫(yī)學院基因檢測實驗室進行。1.3.1熒光高效分析1)主要儀器與試劑:EGFELISA試劑盒,內(nèi)含標準EGF液、多克隆抗體、染色液、終止液、酶等(Chemicon公司,美國);微量反應板(R﹠D公司,美國);HTS700型紫外熒光高效分析儀(PE公司,美國)。2)檢測方法:將標準EGF液與未知EGF質(zhì)量濃度的唾液標本分別與兔抗人EGF多克隆抗體發(fā)生特異性結合,加入酶標底物,出現(xiàn)顏色反應。測出所有標本的光密度(op-ticaldensity,OD)值,由標準質(zhì)量濃度的EGF與其OD值做標準曲線,因為顏色的深淺與EGF質(zhì)量濃度成正比,所以通過標準曲線可測出唾液標本的EGF質(zhì)量濃度。1.3.2檢測儀器和方法1)實驗流程:常規(guī)提取活檢組織塊的總RNA,用熒光分光光度計測定組織塊總RNA質(zhì)量濃度為80μg/mL,然后通過EGFR-RNA的引物熒光標記進行FQ-RT-PCR分析,測定組織塊總RNA中EGFR-RNA的相對含量(拷貝數(shù))。2)主要儀器及試劑:小量組織/細胞總RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司);RT-PCR試劑盒(Roche公司,美國);紫外熒光分光光度計(日本島津公司);94型電泳儀(Bio-Rad公司,美國);FQ-RT-PCR儀(Roche公司,美國)。3)引物設計:EGFR-RNA的PCR特異性引物設計參見參考文獻,由成都天泰公司提供。F-Primer113120bp和R-Primer113820bp;5′端引物序列為5′-CTA-TGAGATGGAGGAAGACG-3′,3′端引物序列為5′-CAGAGGAGGAGTATGTGTGA-3′。4)循環(huán)程序設定:首先55℃孵育10min,95℃30s;然后變性95℃6s,退火55℃10s,延伸72℃15s,共45個循環(huán)。再孵育40℃30s,95℃10s,65℃10s,95℃10s。擴增產(chǎn)物根據(jù)熒光顯示強度,與FQ-RT-PCR儀電腦設定的最大信號進行對照,用該設備的電腦軟件計算待測標本EGFR-RNA的相對含量(拷貝數(shù))。5)陰性對照為反應體系不加cDNA模板。1.4統(tǒng)計分析采用SPPS9.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,三組間比較采用方差分析,檢驗水準為雙側α=0.05。2egf質(zhì)量濃度與性別、年齡的關系RAU1組潰瘍期、間隙期和對照1組唾液EGF質(zhì)量濃度檢測結果見表1。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗,RAU1組潰瘍期患者唾液EGF質(zhì)量濃度高于間隙期和對照1組,有統(tǒng)計學差異(F=3.24,P<0.05);而RAU1組間隙期唾液EGF質(zhì)量濃度低于對照1組(t=2.73,P<0.05)。在EGF質(zhì)量濃度與性別的關系上,RAU1組潰瘍期和間隙期男性與女性的唾液EGF質(zhì)量濃度無統(tǒng)計學差異(P>0.05);對照1組男性與女性的唾液EGF質(zhì)量濃度也無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在EGF質(zhì)量濃度與年齡的關系上,RAU1組和對照1組唾液EGF質(zhì)量濃度與年齡均無相關性,相關系數(shù)分別為r=0.03,P=0.33;r=0.02,P=0.11。RAU2組與對照2組的EGFR檢測結果分別見圖1和圖2。圖1顯示RAU2組起始模板量高,拷貝數(shù)大;圖2表明RAU2組峰值高,起始模板量大。RAU2組EGFR-RNA的相對平均含量為3.097,對照2組為1.965,兩組間有統(tǒng)計學差異(t=3.15,P<0.05),RAU2組EGFR-RNA表達強度高于對照2組。3帶血管人口pb:rau患者間隙期濾液egf質(zhì)量濃度與口腔復發(fā)性的關系本研究結果表明,RAU1組潰瘍期患者唾液EGF質(zhì)量濃度高于對照1組(P<0.05),可能是人體對潰瘍存在時的應答反應,這與RAU能自愈但比正常黏膜受創(chuàng)傷后自愈速度慢的現(xiàn)象相吻合。Wright等認為,消化道任何潰瘍形成后都能誘導干細胞形成新的EGF分泌體系,分泌大量的EGF,刺激細胞增殖、再生,促進潰瘍愈合。RAU患者出現(xiàn)潰瘍后,可能在一些炎性介質(zhì)刺激或者不明因素作用下引起神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)反應,促使頜下腺及其他腺體大量分泌EGF,但在什么環(huán)節(jié)上推動RAU的愈合尚未明確。RAU1組間隙期患者唾液EGF質(zhì)量濃度低于對照1組,筆者推測RAU的發(fā)生與唾液EGF質(zhì)量濃度降低有關,與其他學者關于胃潰瘍與體液EGF質(zhì)量濃度相關的結論類似。唾液中EGF對胃黏膜有保護作用,頜下腺摘除后胃腔內(nèi)的EGF減少,雖然不會發(fā)生自發(fā)性潰瘍,但黏膜對損傷的敏感性增加,容易遭受攻擊因子的破壞而形成潰瘍;胃腔內(nèi)給予外源性EGF后,可預防實驗性胃潰瘍的發(fā)生或者促進胃潰瘍的愈合。胃潰瘍患者在潰瘍活動期間,唾液中EGF質(zhì)量濃度明顯低下,胃液中EGF質(zhì)量濃度也較慢性胃炎患者明顯降低,提示唾液EGF質(zhì)量濃度低下可能是消化性潰瘍患者易感性增加的原因之一。對RAU患者進行胃鏡檢查,發(fā)現(xiàn)胃、十二指腸存在與口腔潰瘍相似的散在小潰瘍;也有報道RAU患者發(fā)病前有口干、唾液量減少的癥狀。唾液中EGF主要來源于腮腺與頜下腺,頭頸部腫瘤放療后患者口腔黏膜容易出現(xiàn)口腔潰瘍,可能與唾液減少或者EGF減少有關。從口腔黏膜上皮細胞層的生長趨向來看,口腔黏膜上皮層次的穩(wěn)定性取決于基底細胞層增殖分化的速度與角化細胞層脫落的速度相等,當前者變慢和/或后者變快時都會導致口腔黏膜上皮變薄,抵抗力降低,易于發(fā)生潰瘍。唾液EGF質(zhì)量濃度升高時,黏膜修復能力加快;降低時基底細胞層增殖分化的速度變慢,潰瘍愈合減慢。本研究結果顯示RAU患者間隙期唾液EGF質(zhì)量濃度低于正常人,這提示EGF與口腔潰瘍復發(fā)性之間存在相關性,但是RAU患者病程長短是否與唾液中EGF質(zhì)量濃度高低有關,尚待進一步研究。由于影響口腔黏膜上皮生長的因素很多,除EGF外,還有成纖維細胞生長因子b、轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮內(nèi)五肽等,因此還需深入探討。本實驗結果表明,RAU患者間隙期唾液EGF質(zhì)量濃度雖然低于正常人,但在臨床實踐中恰當使用免疫調(diào)節(jié)劑、免疫增強劑或免疫抑制劑均能有效減少RAU的發(fā)作頻率,那么免疫系統(tǒng)是否也參與了EGF的生成呢?雖然有關EGF生成的具體機制還不明確,但是目前可以肯定的是巨噬細胞及其他淋巴細胞和角化細胞都可以內(nèi)分泌EGF,并與頜下腺和腮腺外分泌EGF并行不悖。另外EGF也可以影響人類白細胞抗原Ⅱ的表達,后者的表達紊亂與免疫失控有關。筆者推測,免疫制劑可雙向調(diào)節(jié)免疫細胞的活性,可能使EGF的內(nèi)分泌達到恰當?shù)乃?彌補了唾液EGF的不足,間接縮短了RAU病程和減少潰瘍的復發(fā)?？谇恢蠩GFR存在于黏膜上皮和黏膜下結締組織中。目前認為,一種生長因子可以對應一種或者多種受體,一種受體也可以對應一種或多種生長因子,相互間有不同的親和力和選擇性。目前有關這方面的研究雖然很多,但具體機制仍不明朗。有學者在動物實驗中發(fā)現(xiàn),EGFR在消化道潰瘍愈合期上皮細胞中的表達高