微衛(wèi)星dna標(biāo)記的應(yīng)用

微衛(wèi)星dna標(biāo)記的應(yīng)用

微衛(wèi)星dna標(biāo)記是經(jīng)過rill技術(shù)開發(fā)的下一代分子遺傳標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星DNA的PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法主要有同位素標(biāo)記引物的聚丙烯酰胺電泳法、熒光標(biāo)記引物的測(cè)序法以及聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法等。自20世紀(jì)80年代以來,經(jīng)過二三十年的不斷發(fā)展,微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)因其數(shù)量大、分布廣且均勻、多態(tài)性豐富、呈孟德爾共顯性遺傳、檢測(cè)快速方便以及結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。1簡(jiǎn)單重復(fù)序列和分子標(biāo)記的發(fā)展1974年,Skinner等在研究寄居蟹的基因組時(shí)發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列。此后,在人、動(dòng)物和酵母的基因組中都發(fā)現(xiàn)了類似大量的簡(jiǎn)單重復(fù)序列。直到1986年,Ail等首次用合成的微衛(wèi)星寡核苷酸作為探針用于人的指紋分析,這時(shí)才得到重視。1988年,Jeffreys等人做了進(jìn)一步的研究并使之發(fā)展成為新的遺傳分子標(biāo)記系統(tǒng)。1989年,Litt等[1擴(kuò)增到了人類基因組微衛(wèi)星序列,從而創(chuàng)造了“微衛(wèi)星(microsatellite)”這個(gè)名稱。2ts與str微衛(wèi)星DNA又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeats,STR),是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(一般是1~6個(gè))為單位串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。這些重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)和重復(fù)程度在不同的生物體內(nèi)高度變化,并且隨機(jī)分布于真核生物基因組中。普遍認(rèn)為,在染色體上,除著絲粒及端粒區(qū)域外,其他區(qū)域也廣泛散在分布有微衛(wèi)星位點(diǎn)。Weber根據(jù)微衛(wèi)星核心序列排列方式的不同,將其分為完全(無間隔)、不完全(有非重復(fù)單位的堿基間隔)和復(fù)合型(2個(gè)或更多重復(fù)單位彼此毗鄰連續(xù)出現(xiàn))微衛(wèi)星3種類型。3私衛(wèi)星dna標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)3.1微衛(wèi)星標(biāo)記的特點(diǎn)(1)分布廣泛。微衛(wèi)星DNA廣泛且均勻地分布于真核生物基因組中。(2)多態(tài)性豐富。由于微衛(wèi)星在不同個(gè)體中的重復(fù)單位數(shù)目變異大,因而造成其長(zhǎng)度具有高度的多態(tài)性,使其可以包含大量豐富的信息。(3)簡(jiǎn)易高效安全性。微衛(wèi)星檢測(cè)方法簡(jiǎn)便且效率高,單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)間很短,一般不超過24h,并可以多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。微衛(wèi)星標(biāo)記沒有任何表型效應(yīng),因而不存在對(duì)家畜個(gè)體的有害或次級(jí)效應(yīng)。(4)保守與通用性。微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性以及物種間某些染色體區(qū)段的共線性,某一物種的微衛(wèi)星引物可以應(yīng)用于相近物種。(5)共顯性遺傳。微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因遵循孟德爾共顯性遺傳,因而易區(qū)分純合型和雜合型。3.2缺點(diǎn)(1)建立和篩選基因文庫(kù),進(jìn)行克隆和測(cè)序,都是非常繁瑣、耗時(shí)的工作。(2)由于不同物種的微衛(wèi)星側(cè)翼序列不盡相同,因此針對(duì)不同物種設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物也非常耗時(shí)。(3)微衛(wèi)星進(jìn)化具有復(fù)雜性,可能出現(xiàn)同源異型或異源同型。(4)PCR擴(kuò)增受許多因素的影響,使一些等位基因無法被擴(kuò)增出來,即“無效基因”。影響親子鑒定的正確性。(5)目前還沒有發(fā)現(xiàn)哪個(gè)DNA探針能很好地匹配他們各自的多態(tài)性。4私衛(wèi)星dna標(biāo)記的應(yīng)用4.1微衛(wèi)星位點(diǎn)和標(biāo)記的定位與構(gòu)建微衛(wèi)星DNA既可作為探針用于雜交分析,又可以根據(jù)其后序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測(cè)。因而,構(gòu)建遺傳圖譜非常有效。以微衛(wèi)星位點(diǎn)為基礎(chǔ)在基因組中每隔一定距離找一個(gè)多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記,當(dāng)這些標(biāo)記達(dá)到一定的飽和度,也就構(gòu)建出了遺傳連鎖圖。隨著使用微衛(wèi)星標(biāo)記制作基因圖譜的標(biāo)記數(shù)量的增加,飽和度日趨增大,平均距離逐步縮小,遺傳圖譜的精確度隨之提高。4.2微衛(wèi)星標(biāo)記法近年來,遺傳圖譜的進(jìn)展主要是依賴于分子遺傳學(xué)標(biāo)記,特別是微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的不斷發(fā)現(xiàn),利用微衛(wèi)星與功能基因和QTL間的連鎖關(guān)系,使遺傳圖譜上定位的功能基因和QTL不斷增加。Ashwell等通過微衛(wèi)星位點(diǎn)將一個(gè)控制奶牛體細(xì)胞評(píng)分的QTL定位于牛的23號(hào)染色體上,將牛的雙肌基因MH定位于牛的2號(hào)染色體上,與微衛(wèi)星標(biāo)記TGLA-44相連鎖。Georges等首次在美國(guó)核心奶牛群中用159個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行基因組分析,在第1,6,9,10和20號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了對(duì)產(chǎn)奶性狀有影響的QTL。另外,畜禽的大多數(shù)重要經(jīng)濟(jì)性狀表型值受許多基因與環(huán)境因子共同作用,在實(shí)際生產(chǎn)中難以選擇確定,利用微衛(wèi)星標(biāo)記與某些功能基因或QTL的連鎖關(guān)系,可對(duì)功能基因在染色體上的位置及其效應(yīng)進(jìn)行確定和跟蹤,計(jì)算出單個(gè)QTL產(chǎn)生的效應(yīng)值,有效提高品種選育的選擇效率,大大提高了人們對(duì)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的準(zhǔn)確性和預(yù)見性。Forster等使用單標(biāo)記退化、單內(nèi)部圖譜和復(fù)合內(nèi)部圖譜方法,對(duì)多年生黑麥草進(jìn)行了QTL分析,在5個(gè)不同的樣本中觀察到42個(gè)QTL,在連鎖群3,5,7中觀察到相似的QTL;LG3區(qū)域與所有可測(cè)量性狀相聯(lián)系;LG7區(qū)域除CP外,和所有性狀變化相聯(lián)系。4.3排除有利基因利用微衛(wèi)星進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇具有很大潛力,它改變了從表型值推斷基因型值的選擇過程,還可以在育種早期排除那些非必需染色體區(qū)段,有目的的導(dǎo)入有利基因,剔除不利基因。增大選擇強(qiáng)度,定向培育新品種、品系或品系群,縮短世代間隔,提高群體性能,從而大大減短育種年限和降低選育成本。4.4基因型與知識(shí)產(chǎn)權(quán)法相結(jié)合的調(diào)節(jié)利用微衛(wèi)星DNA多態(tài)性及高突變率測(cè)定群體間的遺傳相關(guān)性,可以計(jì)算遺傳距離和遺傳純度,準(zhǔn)確度量群體遺傳變異,測(cè)定選育個(gè)體的基因型與估計(jì)個(gè)體的表型和育種值,這與傳統(tǒng)雜交組合試驗(yàn)相比,減少了繁重的測(cè)定工作,節(jié)省育種時(shí)間與費(fèi)用,從而開展精確選育。有研究發(fā)現(xiàn),用DNA多態(tài)性測(cè)定品種間或品系間的差異,并據(jù)此作出遺傳距離要比其他材料穩(wěn)定。孫少華等利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)分析了肉牛雜交親本群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異,預(yù)測(cè)了最優(yōu)雜交組合并在此基礎(chǔ)上對(duì)18個(gè)肉牛雜交組合的實(shí)際雜交效果利用個(gè)體模型進(jìn)行了評(píng)估。4.5微衛(wèi)星方法進(jìn)行遺傳鑒定在育種實(shí)踐過程中,隨著對(duì)動(dòng)物個(gè)體及其產(chǎn)品要求的提高,準(zhǔn)確的系譜記錄是非常必要的。由于微衛(wèi)星DNA具有高度的個(gè)體專一性和多態(tài)性,已逐步代替了早期使用的血型、血液蛋白等多態(tài)性低的指標(biāo)。用微衛(wèi)星方法來鑒定畜禽的親緣關(guān)系,就是利用微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性,以多個(gè)位點(diǎn)在一定群體中各等位基因的頻率為基礎(chǔ)來進(jìn)行血緣鑒定和血緣控制。張亞平等利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記成功地對(duì)大熊貓進(jìn)行了親子鑒定。張于光等利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記成功地鑒定了7個(gè)父子關(guān)系不明的東北虎。4.6小鼠群體遺傳多樣性檢測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物近交系與普通試驗(yàn)動(dòng)物相比,由于其基因高度純合,遺傳背景清楚而具有極大的優(yōu)越性。由于微衛(wèi)星DNA標(biāo)記有數(shù)量多、重復(fù)性好、可比性強(qiáng)以及共顯性等特點(diǎn),因而被用于近交系動(dòng)物的基因純合度檢測(cè)及遺傳監(jiān)測(cè)等,可有效地檢測(cè)其遺傳質(zhì)量以及其近交程度。謝建云等利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)了來源于2個(gè)單位的近交系BALB/c小鼠和封閉群ICR小鼠,并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果作了遺傳分析。結(jié)果表明,A單位BALB/c小鼠發(fā)生了遺傳污染,有部分小鼠在部分微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)生了變異,而B單位BALB/c小鼠在所有的檢測(cè)位點(diǎn)上的結(jié)果都與預(yù)期的BALB/c小鼠位點(diǎn)一致;對(duì)ICR小鼠分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),A單位ICR小鼠在22個(gè)位點(diǎn)的平均雜合度為0.379,平均多態(tài)信息量為0.308,屬中度多態(tài),B單位ICR小鼠的平均雜合度為0.287,平均多態(tài)信息量為0.227,屬低度多態(tài)。李凱等利用14對(duì)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)了五指山小型豬F13-F18世代的3個(gè)近交家系。結(jié)果表明,在14個(gè)微衛(wèi)星基因座上共檢測(cè)到38個(gè)等位基因,群體平均基因雜合度仍高達(dá)0.42,平均信息含量處于相當(dāng)高的水平,這非?？陀^地反映了“五指山豬”的近交程度并沒有達(dá)到培育者所宣稱的那樣高。牛榮等利用35個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)版納微型豬近交系5個(gè)家系進(jìn)行了遺傳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)版納微型豬近交系5個(gè)家系均具有很高的近交水平,其多態(tài)性信息含量都非常低,且各家系均已構(gòu)成獨(dú)立的遺傳群體。4.7期生養(yǎng)品的遺傳穩(wěn)定性研究生物個(gè)體或群體間表現(xiàn)出來的各種遺傳變異,在本質(zhì)上就是DNA的差異,因此通過研究DNA的變異來分析遺傳多樣性及群體的遺傳結(jié)構(gòu)比其他方法都更為直接和準(zhǔn)確。牛榮等利用35個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)貴州小型豬、廣西巴馬小型豬的封閉群進(jìn)行了遺傳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)品系均有穩(wěn)定的遺傳,且二者的親緣關(guān)系較近。孫少華用6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析8個(gè)肉牛雜交親本群體的遺傳變異。Krishna用18個(gè)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星DNA引物對(duì)48個(gè)瓦倫西亞花生品種進(jìn)行了研究,擴(kuò)增出了120個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),平均每個(gè)引物6.9個(gè)等位基因,經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),瓦倫西亞花生有相當(dāng)大的遺傳多態(tài)性。而根據(jù)已建立的基因圖譜,利用微衛(wèi)星DNA多態(tài)性可以反映物種的進(jìn)化歷史,還可以在DNA水平上更精確地分析物種的進(jìn)化速度、遺傳距離以及由此推斷系統(tǒng)的進(jìn)化與演變,用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)繪制的系統(tǒng)發(fā)生樹要比其他分子遺傳學(xué)標(biāo)記更為精確和高效。Buchanan等用微衛(wèi)星標(biāo)記研究了5個(gè)不同羊品種間的遺傳距離與進(jìn)化關(guān)系。Estoup等采用7個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)9群西方蜜蜂,進(jìn)行分析,證明西方蜜蜂由3個(gè)親緣較遠(yuǎn)的血統(tǒng)進(jìn)化而來。4.8注重遺傳多樣性評(píng)估和遺傳穩(wěn)定性生物物種的滅絕,也就意味著該物種所攜帶的遺傳物質(zhì)將隨之消失,導(dǎo)致遺傳多樣性下降。因此,遺傳多樣性水平的度量和保護(hù)已成為生物多樣性研究的主要內(nèi)容。通過微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)遺傳多樣性的評(píng)估,可檢測(cè)個(gè)體基因型,統(tǒng)計(jì)群體中的微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因的數(shù)目和頻率,了解物種的遺傳結(jié)構(gòu)和生活背景,分析其進(jìn)化的歷史。結(jié)合分子遺傳學(xué)和數(shù)量遺傳學(xué)原理,計(jì)算各個(gè)品種的遺傳變異關(guān)系。對(duì)目標(biāo)基因在保種群世代傳遞過程中的分離和重組進(jìn)行跟蹤,通過有意識(shí)地選留,防止目標(biāo)基因由于遺傳漂變而丟失,并探討品種瀕危的原因,提出合理的保種措施。張亞平等用微衛(wèi)星DNA進(jìn)行圈養(yǎng)大熊貓的親子鑒定,發(fā)現(xiàn)在一雌多雄交配過程中,只對(duì)個(gè)別雄性是有效的。該研究還進(jìn)一步結(jié)合微衛(wèi)星DNA的鑒定結(jié)果,制定了繁殖計(jì)劃,以防止近交衰退。4.9人類疾病的診斷和移植(1)法醫(yī)科學(xué)。微衛(wèi)星DNA在法醫(yī)科學(xué)中一般稱為短串聯(lián)重復(fù),已被應(yīng)用于法醫(yī)鑒定中,比較經(jīng)典的就是先尋找并獲取與犯罪嫌疑人有關(guān)的皮膚、血液、精液、頭發(fā)等殘留組織,從中提取DNA,利用微衛(wèi)星的基因圖譜與疑犯的微衛(wèi)星檔案對(duì)比來判斷真正的罪犯。(2)人類疾病的診斷研究。近年來發(fā)現(xiàn),基因內(nèi)外的一些微衛(wèi)星DNA重復(fù)序列與遺傳病的發(fā)病有關(guān)。例如與三核苷酸重復(fù)片段擴(kuò)增突變有關(guān)的脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA)、強(qiáng)制性肌營(yíng)養(yǎng)不良(DM)等。由于造血干細(xì)胞移植手術(shù)的成功與否,主要取決于植入的干細(xì)胞能否在受體體內(nèi)順利生長(zhǎng)。微衛(wèi)星DNA也已被廣泛應(yīng)用于造血干細(xì)胞的移植檢測(cè)。呂德堅(jiān)等的研究表明,使用復(fù)合擴(kuò)增多個(gè)微衛(wèi)星技術(shù)來監(jiān)測(cè)臍血移植,在沒有受體移植前或供體的對(duì)照樣本時(shí),也可以檢驗(yàn)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MSI(microsatelliteinstability),是由于DNA復(fù)制錯(cuò)誤引起的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失的情況下又沒得到DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的修復(fù)而產(chǎn)生的。MSI首先在結(jié)腸癌和直腸癌中發(fā)現(xiàn),后來隨著深入研究,MSI在肺癌、胃癌、白血病等其他腫瘤中也相繼發(fā)