豬近交系主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞lr2表達(dá)及l(fā)r2介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞lr2的表達(dá)

豬近交系主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞lr2表達(dá)及l(fā)r2介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞lr2的表達(dá)

0血管內(nèi)皮功能異常【研究意義】小型豬（wzbs）的雜交系統(tǒng)（國(guó)家發(fā)明獎(jiǎng)（zl081430.9））是中國(guó)寶貴的小型豬資源之一，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京獸醫(yī)研究所培育。大量研究結(jié)果證實(shí),WZSP近交系是生物醫(yī)學(xué)研究的理想供體,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、畜牧獸醫(yī)學(xué)和人比較醫(yī)學(xué)研究。血管內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管功能和維持血管內(nèi)環(huán)境中起重要作用,許多心血管疾病的發(fā)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常有關(guān)。目前,血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)已廣泛用于心血管疾病的研究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法基本上都是在Jaffe等方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)并形成的,細(xì)胞的材料多來(lái)源于人,如人的臍靜脈和脈動(dòng)脈等。近年來(lái),關(guān)于牛、兔、鼠和豬等來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞體外成功培養(yǎng)均有報(bào)道。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病。Toll樣受體(toll-likereceptors,TLRs)TLR2是一種介導(dǎo)天然免疫的跨膜信號(hào)傳遞受體,其在A(yíng)S的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用;并且已證實(shí)其在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處內(nèi)皮細(xì)胞中高效表達(dá),而且血管分支處及血流動(dòng)力學(xué)改變部位的內(nèi)皮細(xì)胞TLR2的表達(dá)量也明顯升高。高脂飲食誘導(dǎo)發(fā)生AS的TLR2/LDLR雙基因缺失小鼠和LDLR基因缺失小鼠相比較,TLR2的缺失明顯抑制了AS的發(fā)生發(fā)展。許多學(xué)者致力于研究TLR2在促進(jìn)AS和炎癥反應(yīng)中作用,但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,TLR2在豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其在介導(dǎo)細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá)情況未見(jiàn)報(bào)道;為此,本試驗(yàn)利用WZSP近交系主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型,探討TLR2在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)中的作用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】進(jìn)一步揭示TLR2在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用,為今后進(jìn)一步研究WZSP近交系內(nèi)皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制以及TLR2在A(yíng)S中的作用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法本試驗(yàn)于2009年9月—2010年10月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所進(jìn)行。1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物WZSP近交系由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供,選取3—4月齡、體重10kg左右、健康狀態(tài)良好的五指山小型豬進(jìn)行試驗(yàn)。1.2試劑和儀器I型膠原酶、DMSO及LPS均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、胰酶、谷氨酰胺及D-PBS為GIBCO公司產(chǎn)品;CellCountkit(CCK8)為日本DojindoLaboratories的產(chǎn)品;LTA為invivogen公司產(chǎn)品;DiI-Ac-LDL購(gòu)自友誼中聯(lián)生物科技有限公司;小鼠抗豬的CD31﹕RPE單克隆抗體為英國(guó)AbDSerotec公司產(chǎn)品;RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;熒光定量PCR試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司;熒光定量PCR的引物由上海英俊公司合成。1.3血管內(nèi)皮的制備打開(kāi)3—4月齡WZSP近交系的胸腔和腹腔,剝離胸腹主動(dòng)脈,將其兩端結(jié)扎并切斷,放入含雙抗的PBS液(pH=7.4,下同)中帶回細(xì)胞室。將主動(dòng)脈放在無(wú)菌平皿中,剔除外膜周?chē)慕Y(jié)締組織,用含雙抗的PBS沖洗主動(dòng)脈外膜2—3次;解開(kāi)主動(dòng)脈結(jié)扎的兩端,用含雙抗的PBS沖洗主動(dòng)脈血管腔的內(nèi)膜,至清亮液體流出。將整根主動(dòng)脈剪成3cm左右的小段,用無(wú)菌棉線(xiàn)結(jié)扎一端,使用兩把頓頭鑷子配合將血管的內(nèi)膜外翻,放入0.1%的I型膠原酶溶液中使血管內(nèi)膜充分接觸酶液,于37℃消化15min。消化結(jié)束,吸取消化液,沖洗已被膠原酶消化松動(dòng)的內(nèi)皮細(xì)胞。收集液體轉(zhuǎn)至新的滅菌離心管中,于1000r/min離心5min,棄掉上清液,細(xì)胞沉淀用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸、混勻,加入到培養(yǎng)瓶中。置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中,于37℃、5%CO2和飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。1.4細(xì)胞傳代處理當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí),棄去培養(yǎng)液,用PBS清洗2次,加入0.25%胰酶消化細(xì)胞,于顯微鏡下觀(guān)察。當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始變圓時(shí),用含有血清的培養(yǎng)基終止消化,吹打細(xì)胞使其完全脫落,以1﹕2的比例進(jìn)行傳代。取傳至第2代的細(xì)胞,胰酶消化法收集細(xì)胞,離心棄上清,用細(xì)胞凍存液(10%DMSO+30%FBS+60%DMEM)重懸細(xì)胞,–80℃冰箱過(guò)夜,次日投入液氮罐中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),從液氮中取出凍存管,于38℃水浴鍋中融化,離心棄上清,加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。1.5cck8對(duì)od值的測(cè)定取第3代的內(nèi)皮細(xì)胞,用0.25%的胰酶消化后,以2.0×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板。每天在相同時(shí)間點(diǎn)向3個(gè)平行的孔內(nèi)加入CCK8,2h后吸取細(xì)胞上清液在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)OD值,連續(xù)定時(shí)測(cè)定7d。同時(shí),另外選一孔作陰性對(duì)照,不添加CCK8,只是與同時(shí)間吸取上清測(cè)OD值。根據(jù)測(cè)得OD值與對(duì)應(yīng)天數(shù)繪制曲線(xiàn)。1.6動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的識(shí)別1.6.1管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞株(PIEC)作為對(duì)照組,將主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后去除培養(yǎng)液,每孔加入終濃度為10μg·mL-1DiI-Ac-LDL的完全培養(yǎng)液37°C孵育4h后于熒光顯微鏡下觀(guān)察。1.6.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞系統(tǒng)中蛋白mf細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞收集3管主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和1管豬血管內(nèi)皮細(xì)胞株(porcinevascularendothelialcellline,PIEC),每管1.0×106個(gè),加入PBS沖洗2—3次,棄上清,分為空白對(duì)照(不加抗體),陰性對(duì)照(加同型對(duì)照抗體,并無(wú)細(xì)胞抗原特異性)和抗體CD31標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.7細(xì)胞炎癥因子以1.0×105個(gè)/孔的細(xì)胞濃度接種于12孔培養(yǎng)板,參考文獻(xiàn)報(bào)道,并經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)后,選取濃度為1μg·mL-1LPS添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中0、6、8和12h后,利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR2和TLR4的表達(dá)量。1μg·mL-1LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞12h后,換液添加10μg·mL-1LTA或無(wú)LTA的完全培養(yǎng)液孵育0、6和12h,提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的表達(dá)量(引物見(jiàn)表1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20μL,即RealMasterMix(SYBRgreen)9μL,cDNA1μL,正、反向引物各0.6μL,無(wú)菌水8.8μL,總體積為20μL。擴(kuò)增條件:95℃2min;95℃15s、60℃30s、68℃30s,共40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)于68℃延伸期收集熒光信號(hào);95℃15s、60℃15s,作60—95℃范圍的融解曲線(xiàn)。在A(yíng)BI熒光定量PCR儀7500反應(yīng)完畢后,由SDS軟件自動(dòng)分析結(jié)果?；虻谋磉_(dá)分析利用比較Ct法的相對(duì)定量,Ct值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。假設(shè)目的基因與管家基因擴(kuò)增效率相同,數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出,目的基因的量=2-△△Ct?！鳌鰿t=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照,以管家基因GAPDH為內(nèi)參。2-△△Ct表示試驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。1.8免疫組化檢測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“?x±s”表示,用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異性比較采用單因素方差分析,以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出,以至于酶液不能和內(nèi)皮細(xì)胞充分接觸,起不到很好的消化作用。將血管內(nèi)膜外翻可以改進(jìn)這種方法,不僅方便將內(nèi)膜表層沖洗干凈,避免血紅細(xì)胞的殘留;也能使內(nèi)皮細(xì)胞層和消化酶液充分接觸,避免了外膜接觸酶液導(dǎo)致消化液中混入雜細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定也很重要,是細(xì)胞培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)。鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的方法很多,首先顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。本試驗(yàn)分離的細(xì)胞匯合長(zhǎng)成單層后形態(tài)為鋪路石樣整齊排列,細(xì)胞呈不規(guī)則的多角形和短梭形,符合內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征。其次可以做細(xì)胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫組化檢測(cè)或Ac-LDL受體的表達(dá)檢測(cè)。第Ⅷ因子相關(guān)抗原是血管內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)可靠的標(biāo)記物,多采用熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)。檢測(cè)Ac-LDL受體采用直接摻入DiI標(biāo)記的Ac-LDL,通過(guò)熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞吸收Ac-LDL的結(jié)果,證明細(xì)胞表面是否有此種受體。另外,CD31也是內(nèi)皮細(xì)胞一個(gè)標(biāo)志性的表面分子。本試驗(yàn)分離培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞吸收DiI-Ac-LDL后,可觀(guān)察到細(xì)胞質(zhì)有明顯的紅色熒光,并且流式細(xì)胞儀鑒定CD31分子表達(dá)為陽(yáng)性,證實(shí)本試驗(yàn)分離的細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。TLRs是一類(lèi)介導(dǎo)天然免疫的信號(hào)傳遞受體,能夠識(shí)別特異的PAMPs,介導(dǎo)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答。對(duì)豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞幾乎不表達(dá)TLR2,不能對(duì)LTA產(chǎn)生免疫應(yīng)答。那么在免疫炎癥反應(yīng)中革蘭氏陽(yáng)性菌是如何激活內(nèi)皮細(xì)胞的?本試驗(yàn)通過(guò)LPS刺激主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞后TLR2表達(dá)量明顯升高,進(jìn)而能夠?qū)TA產(chǎn)生應(yīng)答;與無(wú)LTA刺激的細(xì)胞相比,內(nèi)皮細(xì)胞TLR2與LTA結(jié)合引起細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的顯著表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道,P.gingivalis細(xì)菌感染人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)TLR2和TLR4的表達(dá)量升高;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α、LPS或IL-1β刺激后,能顯著增加TLR2mRNA水平表達(dá)量,并且內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)TLR2對(duì)LTA產(chǎn)生應(yīng)答,引起炎癥因子E-selectin和IL-8的表達(dá)量升高。同時(shí),研究報(bào)道,來(lái)自H.pylori和P.gingivalis兩種細(xì)菌的LPS導(dǎo)致了TLR2持續(xù)激活內(nèi)皮細(xì)胞,在A(yíng)S斑塊發(fā)生的炎癥反應(yīng)應(yīng)答中起了重要作用。通過(guò)發(fā)生AS小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在血流動(dòng)力學(xué)紊亂的部位,如血管分支處TLR2的表達(dá)及活性均增加,并促進(jìn)EC的活化,引起