近交系hfj大鼠和wisar大鼠脂肪肝胰島素抵抗模型的建立及其生物學特性比較

近交系hfj大鼠和wisar大鼠脂肪肝胰島素抵抗模型的建立及其生物學特性比較

大鼠是目前研究糖尿病、高血壓、冠狀動脈粥樣硬化和高血壓的最重要動物之一。以往的研究多選用封閉群動物Wistar或SD大鼠以高脂飼料誘導的造模方法,其特點是簡便易行、成模率高。HFJ大鼠是我單位實驗動物中心新培育的近交系大鼠,已近親繁殖到第26代。經(jīng)研究證實,已符合近交系大鼠特征。該品系大鼠繁殖力高、仔鼠發(fā)育良好,初步檢測發(fā)現(xiàn)具有自發(fā)高甘油三酯和高膽固醇特性(蔡月花等,2009)。高血脂常與胰島素抵抗、脂肪肝、動脈粥樣硬化與糖尿病等疾病密切相關(guān),因此本研究通過喂養(yǎng)高脂飲食,建立HFJ大鼠和封閉群Wistar大鼠的脂肪肝和胰島素抵抗動物模型,比較兩種大鼠疾病模型差異,分析高血脂與脂肪肝和胰島素抵抗之間關(guān)系,為探究胰島素抵抗及脂肪肝的發(fā)生機制提供新的疾病動物模型。1材料和方法1.1實驗動物及設(shè)備清潔級Wistar大鼠和近交系HFJ大鼠各20只,雄性,年齡6～8周,體重180～200g,由河北醫(yī)科大學實驗動物學部提供,實驗動物許可證號:SCXK(冀)2008-1-003。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物實驗室IVC籠具中,實驗動物使用許可證號為:SYXK(冀)2008-0026。動物實驗過程中按照“3R”原則,在動物手術(shù)和安樂死實施中給予人道關(guān)懷。HFJ大鼠和Wistar大鼠分別隨機分為模型組和正常組。1.2高脂飼料的組成將大鼠分為正常組和模型組,正常組喂飼普通飼料,蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物提供能量分別為25.8%、19.2%、55%;模型組喂飼高脂飼料(普通飼料加15%豬油、1%膽固醇和0.5%膽酸鹽),蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物提供能量分別為17.7%、44.2%、38.1%。以上動物飼料由河北省實驗動物中心提供,飼料生產(chǎn)許可證號:SYXK(冀)2008-2-001。1.3血糖、血脂、alt、ast的測定采用KY-190型全自動生化分析儀(南京特康生化分析儀器有限公司)進行血糖、血脂、ALT、AST測定,試劑盒購自中生北控生物科技有限公司,胰島素放射免疫試劑盒購自中國原子能科學研究院同位素研究所,膽固醇購自北京鼎國公司,膽酸鹽購自北京奧博星公司,豬油購自雙匯集團。1.4動物造模及模型建立大鼠在IVC環(huán)境中飼養(yǎng),自由進食飲水,溫度(20±2)℃,明暗各12h。正常組喂飼普通飼料,模型組先用普通飼料和高脂飼料混合喂養(yǎng)1周,然后改為全高脂飼料喂養(yǎng),持續(xù)喂養(yǎng)12周,大鼠空腹12h后麻醉,左心室采血,分離血清用于血液指標測定,并迅速摘取肝臟,用于病理學觀察。1.5胰島素抵抗指數(shù)檢測每周稱量大鼠體重,實驗期末處死動物摘取肝臟并稱質(zhì)量,計算肝指數(shù)=肝濕重(g)/體重(g)×100%。采用全自動生化分析儀測定血清中血糖、甘油三酯、膽固醇、ALT、AST、HDLC、LDLC的濃度,采用放免法測定血清胰島素濃度。計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖濃度×空腹胰島素濃度/22.5。大鼠肝臟用10%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色。光鏡下評估肝脂肪變性和炎癥活動情況。統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析。2結(jié)果2.1模型大鼠體重增長的比較Wistar大鼠正常組與模型組體重變化差異無顯著性(P>0.05),HFJ大鼠模型組體重增長明顯高于正常組(P<0.01);在正常飲食喂養(yǎng)情況下,Wistar大鼠體重增長明顯快于HFJ大鼠(P<0.01)。HFJ近交系大鼠和Wistar大鼠的生長曲線見圖1。肝指數(shù)模型組比正常組顯著增高(P<0.01)(表1)。2.2胰島素抵抗指數(shù)模型組和正常組的空腹血糖水平相近,模型組的空腹胰島素水平明顯高于正常組,模型組和正常組胰島素抵抗指數(shù)差異有顯著性(P<0.01),但HFJ和Wistar之間差異無顯著性(P>0.05),結(jié)果見表1。2.3血清g、hfj、ldlc水平兩種大鼠間比較,HFJ大鼠正常組和模型組的血清TG和TC水平均高于Wistar大鼠(P<0.05),但兩個品系大鼠模型組TG含量均低于正常組水平,差異有顯著性(P<0.05),模型組與正常組血清TC差異無顯著性(P>0.05);血清HDLC水平模型組低于正常組(P<0.05),HFJ大鼠LDLC水平高于Wistar大鼠(P<0.05);模型組大鼠AST、ALT明顯高于正常水平,與正常組相比差異有顯著性(P<0.05),且HFJ大鼠AST水平高于Wistar大鼠(P<0.05)(表2)。2.4肝組織病理學檢測肝臟表面觀察,正常組大鼠無異常變化,模型組大鼠肝臟體積明顯增大、包膜緊張、邊緣圓鈍、肝臟呈奶黃色、切面油膩。光鏡下,正常組肝細胞索排列正常,核圓、大、居中,無脂滴和炎癥細胞浸潤。模型組Wistar和HFJ大鼠肝臟均出現(xiàn)彌漫性脂肪變性,肝細胞體積增大,胞漿中有大量脂滴空泡,核居邊,且小葉內(nèi)有炎癥細胞浸潤,但均未見肝纖維化;其中Wistar大鼠肝脂肪變性較輕,肝小葉內(nèi)部分肝細胞界限較清晰,肝竇可見,匯管區(qū)周圍肝細胞脂變較中央靜脈周圍輕,有部分完整可見的肝索(封4,圖2～5)。3脂肪代謝異常隨著生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的變化,非酒精性脂肪肝(NAFLD)己成常見病和多發(fā)病,并且NAFLD可進一步發(fā)展到肝纖維化、肝硬化等嚴重的肝病階段,但其發(fā)病機制至今尚未闡明,亦缺乏有效的治療手段(Blechacz&Stremmel,2003)。研究顯示NAFLD的發(fā)生發(fā)展是由于“二次打擊”所引起,各種因素引起的脂質(zhì)代謝障礙使大量脂肪積聚于肝臟,造成肝脂肪化,這是“第一次打擊”,這一過程的關(guān)鍵是胰島素抵抗?！暗诙未驌簟眲t主要是氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化,胰島素抵抗則貫穿于這“二次打擊”的始終(Day&James,1998)。然而胰島素抵抗在NAFLD中的確切機制還有待進一步研究,包括脂肪肝的胰島素信號轉(zhuǎn)導通路如何改變及其對代謝的影響等。因此選擇合適的脂肪肝及胰島素抵抗動物模型開展基礎(chǔ)研究十分必要。高脂飲食誘導的大鼠模型具備人類脂肪肝特征,并且可以引起肝臟及周圍組織的胰島素抵抗(李晨鐘等,2000;張榮等,2002),符合人類脂肪肝的演變過程,造模方法簡便易行,模型形成率高。目前選用遠交群Wistar或SD大鼠成功構(gòu)建了脂肪肝胰島素抵抗大鼠模型(陳世清等,2005;王威等,2006),然而僅目前這些模型并不能闡明NAFLD的發(fā)病機制,因此需要更多的具備不同特性的模式動物來制備脂肪肝胰島素抵抗動物模型,通過比較進而發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)生發(fā)展的分子機理,為疾病的診斷和治療提供新的方法。HFJ大鼠是我單位實驗動物中心新培育的近交系大鼠,該品系大鼠由一對清潔級Wistar大鼠作為基代,近親繁殖到第26代。初步研究發(fā)現(xiàn)該品系與Wistar大鼠相比較具有自發(fā)性高甘油三酯和高膽固醇特性,而胰島素抵抗、脂肪肝、動脈粥樣硬化和Ⅱ型糖尿病等疾病常與血脂異常密切相關(guān)。因此本研究用含飽和脂肪酸占攝入熱量44.2%的高脂飼料飼養(yǎng)HFJ大鼠12周,生化和病理檢測結(jié)果顯示成功建立了大鼠脂肪肝胰島素抵抗動物模型。與封閉群Wistar大鼠脂肪肝模型比較,HFJ大鼠肝脂肪變性更為明顯,在血脂、LDLC、AST等方面與Wistar大鼠有顯著差異,HFJ大鼠血脂代謝異常特點更為突出。Wistar大鼠模型組體重與正常組無顯著差異,而HFJ大鼠在高脂喂養(yǎng)下體重增長明顯,顯示出對高脂飲食的高敏感性。然而研究中發(fā)現(xiàn)兩品系大鼠禁食12h后,模型組的TG水平均低于其正常組,差異有顯著性(P<0.05)。分析其原因可能是,高脂食物引起血液TG升高,而食物源性的TG主要存在于乳糜微粒(Chylomicrons,CM),禁食12h之后CM從血液廓清,因此食物來源性TG的影響被消除。另外,血脂的調(diào)節(jié)受多種激素的影響,例如胰高血糖素、腎上腺素和去甲腎上腺素是可以促進脂動員的激素,稱為脂解激素(lipolytichormones);胰島素和前列腺素等可抑制脂肪動員,稱為抗脂解激素(antilipolytichormones)。模型組空腹情況下仍持續(xù)維持較高水平的胰島素,可能導致脂肪動員抑制,使血TG水平低于正常組。另外,正常情況下肝臟