大鼠原代肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的同步分離與培養(yǎng)

大鼠原代肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的同步分離與培養(yǎng)

01引言結(jié)果材料和方法討論目錄030204引言引言肝臟是人體最重要的代謝器官之一，其結(jié)構(gòu)和功能在維持機(jī)體正常生理代謝中具有重要意義。在肝臟中，各種細(xì)胞類型如肝原代肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等相互協(xié)作，共同參與了肝臟的代謝、排泄、免疫和血流量調(diào)節(jié)等過程。為了更好地研究肝臟的生理和病理過程，需要對這些不同類型的細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng)。引言本次演示將介紹一種同步分離與培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的方法，為相關(guān)研究提供參考。材料和方法1、材料1、材料實驗動物：健康雄性SD大鼠細(xì)胞培養(yǎng)試劑：DMEM/F12、Hank's溶液、0.25%胰蛋白酶、膠原酶、EDTA、FBS細(xì)胞分離試劑：DispaseⅡ、EGTA、BSA、NaN3細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀等2、方法（1）動物處理（1）動物處理將SD大鼠斷頭處死，剝離肝臟，置于Hank's溶液中清洗，去除血液和雜質(zhì)。（2）肝組織預(yù)處理（2）肝組織預(yù)處理將肝臟組織剪成1cm×1cm的小塊，用DispaseⅡ和EGTA消化，分離出肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。（3）肝細(xì)胞分離（3）肝細(xì)胞分離將肝臟組織剪成1mm×1mm的小塊，用膠原酶消化，分離出肝原代肝細(xì)胞和星狀細(xì)胞。采用兩步膠原酶消化法，即先加入低濃度膠原酶消化30分鐘，再加入高濃度膠原酶消化30分鐘。在消化過程中需不斷搖晃以使組織充分消化。消化完成后，用濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液。（4）枯否細(xì)胞分離（4）枯否細(xì)胞分離將上述細(xì)胞懸液離心，棄上清液，用含BSA的生理鹽水洗滌，再加入含NaN3的生理鹽水去除紅細(xì)胞。然后用含BSA的生理鹽水洗滌并離心，棄上清液。最后加入DMEM/F12培養(yǎng)基，將沉淀的枯否細(xì)胞分散開。（5）細(xì)胞培養(yǎng)（5）細(xì)胞培養(yǎng)將上述分離得到的肝原代肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況適時更換培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)。結(jié)果1、細(xì)胞形態(tài)1、細(xì)胞形態(tài)通過倒置顯微鏡觀察各細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果顯示肝原代肝細(xì)胞呈多角形或圓形，胞質(zhì)豐富，胞核較大；星狀細(xì)胞呈長梭形或橢圓形，胞質(zhì)伸出多個突起；枯否細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，胞質(zhì)豐富，胞核較??；肝竇內(nèi)皮細(xì)胞呈長梭形或多角形，形成單層細(xì)胞。2、細(xì)胞數(shù)量和存活率2、細(xì)胞數(shù)量和存活率通過細(xì)胞計數(shù)和臺盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示各細(xì)胞類型的數(shù)量和存活率均較高，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的存活率略低于其他三種細(xì)胞。3、基因表達(dá)3、基因表達(dá)采用qRT-PCR方法檢測各細(xì)胞中特定基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示肝原代肝細(xì)胞中白蛋白（ALB）和膽固醇合成酶（HMGCS）基因表達(dá)較高；星狀細(xì)胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）基因表達(dá)較高；枯否細(xì)胞中髓過氧化物酶（MPO）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）基因表達(dá)較高；肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表達(dá)較高。這表明四種細(xì)胞在不同基因表達(dá)水平上具有功能差異。討論討論本研究成功地同步分離與培養(yǎng)了大鼠原代肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，為研究肝臟的生理和病理過程提供了可靠的實驗?zāi)Ｐ汀嶒灲Y(jié)果顯示，各細(xì)胞類型的形態(tài)、數(shù)量、存活率和基因表達(dá)均具有特征性差異。這些差異表明它們在肝臟中的功能和作用是不同的。討論例如，肝原代肝細(xì)