實(shí)驗(yàn)一肝細(xì)胞原代分離及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)一、肝細(xì)胞的原代分離及培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)了解掌握組織中細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法掌握臺(tái)酚藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法掌握血球計(jì)數(shù)板使用方法器具中號燒杯，平皿，小鑷子，大鑷子，小剪子，血球計(jì)數(shù)板，手套，試管架、酒精噴壺離心管（15/50ml），吸管、100目孔徑濾網(wǎng)、1ml移液器及Tip頭、研磨玻片試劑胰酶、PBS、臺(tái)酚蘭、75%酒精操作步驟

1、將小鼠斷頸處死，置75%酒精燒杯泡2-3分鐘。斷頸法：小鼠處死最常用的方法，也是小鼠痛苦程度最小的處死方法，符合動(dòng)物福利學(xué)。

小鼠抓持方法注意：小鼠很靈活，頭部固定不牢，易被其反咬?。〔僮鞑襟E2、用針頭將小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。鑷子捏起腹部皮膚，剪刀剪一小口，暴露腹壁。

注意：不要一刀剪破腹壁，這樣毛容易進(jìn)入腹腔，里面就不是無菌的了。

鑷子夾起腹壁，剪開腹腔，取出肝臟，置于培養(yǎng)皿中，剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有PBS液的平皿中。鑷子捏起腹部皮膚，剪刀剪一小口，暴露腹壁。鑷子夾起腹壁，剪開腹腔，取出肝臟，操作步驟3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（約1mm3），再用玻片充分研磨，轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000rpm，5min。注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大操作步驟4、視組織或細(xì)胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃水浴中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用輕柔吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。

操作步驟5、加PBS至50ml，用100目孔徑濾網(wǎng)濾過，除去未消化的大組織塊。

操作步驟6、將通過濾網(wǎng)的細(xì)胞置于15ml離心管中，1000rpm，離心5分鐘，慢慢棄去上清液。注意：將離心管從離心機(jī)取出時(shí)，動(dòng)作要輕 柔，否則細(xì)胞很容易被重新懸起。不要多次傾倒離心管，只傾倒一次。操作步驟7、加入紅細(xì)胞裂解液（Tris-NH4Cl）5ml，沖散細(xì)胞，約2min，裂解紅細(xì)胞。操作步驟7、加入PBS5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。注意：同上操作步驟8、加入含血清的培養(yǎng)液1-2ml（視細(xì)胞量），用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。操作步驟9、稀釋分離的肝細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)染色（細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)酚藍(lán)溶液以9:1混合均勻），用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)活細(xì)胞。臺(tái)酚藍(lán)（TrypanBlue)

：是細(xì)胞活性染料，常用于檢測細(xì)胞膜的完整性。還常用于檢測細(xì)胞是否存活。活細(xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。

血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造每個(gè)大方格面積：1.0毫米×1.0毫米=1.0平方毫米容積：1.0平方毫米×0.1毫米=0.1立方毫米。血球計(jì)數(shù)板使用方法視待測細(xì)胞懸液濃度，加適當(dāng)PBS稀釋細(xì)胞，以每小格的細(xì)胞數(shù)可數(shù)為度。取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)蓋上蓋玻片將細(xì)胞懸液搖勻，用20ul加樣槍吸取少許，從計(jì)數(shù)板蓋玻片邊緣滴入一滴細(xì)胞懸液，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，一次性充滿計(jì)數(shù)室，勿使氣泡產(chǎn)生。邊緣多余的懸液用吸水紙輕輕拭去。血球計(jì)數(shù)板使用方法靜置片刻，待細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板，不再隨液體漂流如細(xì)胞位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。血球計(jì)數(shù)板使用方法計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值使用完畢，用自來水清洗血球計(jì)數(shù)板，勿用硬物洗刷計(jì)數(shù)板計(jì)算公式細(xì)胞數(shù)/ml=(4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)討論注意事項(xiàng)標(biāo)*號為組長，組長負(fù)責(zé)，要提前進(jìn)入狀態(tài)，將各小組進(jìn)行分工，將實(shí)驗(yàn)中所遇到的問題，實(shí)驗(yàn)應(yīng)