分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(任峰)2011

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)任峰華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)?zāi)夸泴?shí)驗(yàn)一植物基因組DNA提取及純化實(shí)驗(yàn)二PCR克隆目的基因?qū)嶒?yàn)三PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物凝膠回收實(shí)驗(yàn)五目的基因片段與載體連接實(shí)驗(yàn)六E.coliDH5α和DE3感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)七連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌實(shí)驗(yàn)八陽性單菌落篩選實(shí)驗(yàn)九重組質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)十重組質(zhì)粒及表達(dá)載體pET酶切分析與電泳實(shí)驗(yàn)十一目的片段回收及與表達(dá)載體連接實(shí)驗(yàn)十二連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)十三陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21實(shí)驗(yàn)十四蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白質(zhì)樣品制備實(shí)驗(yàn)十五SDS檢測誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)一植物基因組DNA提取

基本原理

1.基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交及PCR分離基因等。2.不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。3.在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法,以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酚類物質(zhì)對隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時,應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。4.核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)和核仁里。在制備核酸時，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。5.去除蛋白的方法，通常采用SDS/CTAB等去污劑使蛋白變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取DNA.本實(shí)驗(yàn)是通過SDS法提取擬南芥基因組DNA。1.通過SDS提取擬南芥基因組DNA;2.為從擬南芥基因組DNA克隆目的基因作準(zhǔn)備二實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬x器及耗材：研缽、微量移液器及吸頭、EP管、臺式離心機(jī)。材料：擬南芥小苗試劑：DNAExtractBuffer(0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5);70%乙醇；酚；氯仿；異丙醇;RNase儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)步驟1.取一定量的擬南芥組織;2.加入600μl抽提緩沖液（0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5），室溫下快速研磨;3.把抽提液從研缽中移至1.5ml離心管中，混勻;4.12,000rpm,離心10min(RT)。取上清，加等體積的酚/氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻；5.12,000rpm,5min(RT)，取上清，加等體積的異丙醇，上下顛倒混勻；6.12,000rpm,10min(RT)，棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入1ml的70%乙醇洗沉淀；7.12,000rpm,5min(RT)，棄上清，倒置于紙巾上待其干燥；8加20μlddH2O溶解沉淀;9.在溶解DNA中加入3-5μlRNase，37oC消化2-3h;10.補(bǔ)充ddH2O至總體積400μl，加入等體積的酚/氯仿，混勻；11.12000rpm,5min(RT)，取上清入新的EP管中，用等體積的氯仿再抽提一次,12000rpm,5min(RT)；12.取上清，加入1/10體積的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，并混勻，-20oC放置10min;13.12000rpm,10min,4oC；14.去上清，70％乙醇洗沉淀,12000rpm,5min,4oC；15.去上清，沉淀干燥后，加入ddH2O溶解DNA16.通過分光光度計或電泳檢測DNA的濃度和純度。實(shí)驗(yàn)報告實(shí)驗(yàn)二PCR克隆目的基因一實(shí)驗(yàn)原理

PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法.它包括三個基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(56℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。PCR原理FLASH演示PCR技術(shù)發(fā)展

PCR是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。

它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍。PCR技術(shù)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)。

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。Klenow這些缺點(diǎn)給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

TaqDNAPolymerase1988年Saiki等從水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取耐高溫的TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)，此酶在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%。

缺點(diǎn)：

TaqDNAPolymerase只有5’→3’聚合酶活性，但沒有3’→5’外切活性，無法消除突變和錯配，堿基錯誤摻入率可達(dá)10-4/堿基/循環(huán)PfuDNAPolymerase

PfuDNA

聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，來自于Pyrococcusfuriosis菌株，不僅具有摻入反應(yīng)迅速及熱穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，更是當(dāng)前市場上所有DNA聚合酶中摻入出錯率最低的一種。優(yōu)點(diǎn)：Pfu具有3’→5’校閱功能，其錯配率分別僅為10-7。缺點(diǎn)：效率低，擴(kuò)增片段較短TaqPlusDNAPolymerase

是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物，與TaqDNA聚合酶相比，具有擴(kuò)增長度增加（簡單模板可有效擴(kuò)增20kb,復(fù)雜模板可有效擴(kuò)增10kb),保真度好的特點(diǎn)；與PfuDNA聚合酶相比，具有擴(kuò)增速度快，反應(yīng)效率高的優(yōu)勢。PCR反應(yīng)體系組成模板5’引物和3’引物4種dNTPDNA聚合酶Mg2+反應(yīng)緩沖液1.模板PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子就模板DNA而言,影響PCR的主要因素:

純度:蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性:模板降解會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度:加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加2.引物PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵引物影響因素：特異性：長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性：避免反復(fù)凍融濃度：應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少引物設(shè)計原則(1)引物長度：約為16-30b(2)G+C含量：G+C含量通常為40%-60%,較短引物可粗略估計Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3)四種堿基隨機(jī)分布，在3‘端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。(4)在引物內(nèi)及兩引物之間,尤其在3‘端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。(5)引物5‘端對擴(kuò)增特異性影響不大,可在引物設(shè)計時加上限制酶位點(diǎn)。(6)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)4種dNTP

濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融dNTP原液配成10mM或者2.5mM分裝,-20oC貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μM。當(dāng)dNTP終濃度大于50mM時可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。Mg2+

過高非特異性嚴(yán)重，過低無擴(kuò)增產(chǎn)物Mg2+濃度對DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性,影響引物退火和解鏈溫度,影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-3mM。試劑公司通常會將Mg2+加入到DNA聚合酶的反應(yīng)緩沖液中：10×ReactionBuffer(includingMg2+)10×ReactionBuffer(withoutMg2+)DNA聚合酶TaqDNAPolymerase活性半衰期為95℃40min,97℃5min.TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個致命弱點(diǎn)是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán),100μlPCR反應(yīng)中,1.5-2單位的TaqDNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),需要預(yù)先滅活TaqDNA聚合酶,滅活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。Taq/Pfu/TaqPlusDNAPolymeraseDNA聚合酶單位定義：1個酶單位是指在以下分析條件下，于74℃，30min內(nèi)使10mmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。不同公司提供的酶U的定義也不同。反應(yīng)緩沖液各種DNA聚合酶都有自己特定反應(yīng)緩沖液；TaqDNAPolymerase反應(yīng)緩沖液一般含：10-50mMTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)50mMKCl適當(dāng)濃度的Mg2+緩沖液10mmol/lTris.Cl提供適合反應(yīng)的pH值（pH8.4）50mmol/l

KCl促進(jìn)引物退火10μg/ml明膠或血清白蛋白為Taq酶的保護(hù)劑PCR反應(yīng)主要參數(shù)：1.預(yù)變性：94°C，3--5min2.變性：94°C，30s-1min3.復(fù)性：56°C，20s--2min4.延伸：72°C，30s--3min5.總延伸：72°C，10min預(yù)變性和變性在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性3－5min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全,往往使PCR失敗,因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時間為94℃1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。退火引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。通常退火溫度和時間為55℃左右,1-2min。延伸延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃.實(shí)際上。延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物,這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。1.通過PCR從擬南芥基因組中擴(kuò)增目的基因片段2.學(xué)習(xí)PCR儀等儀器的使用實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟牧希簲M南芥基因組DNA器材：移液器及吸頭，PCR管，PCR儀，臺式離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)材料和器材所需試劑10×PCR反應(yīng)緩沖液dNTPMix:每種10mM5’和3’引物：各10pmol/μl（10μmmol/L）TaqDNA聚合酶5U/μl無菌去離子水；實(shí)驗(yàn)步驟1.在PCR管中依次混勻下列試劑(總體積50μl)5μl10×Buffer(IncludingMgCl2)1μldNTPmix（各10mM）1μl5’上游引物（10μM）1μl3’下游引物（10μM）模板DNA(>200ng)1UTaqDNA聚合酶補(bǔ)充ddH2O至50μl混勻后短暫離心（點(diǎn)離）。2.將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子3.用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1分鐘,72oC延伸2分鐘,32個循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后,于72oC下保溫10分鐘，4.終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存1.PCR非常靈敏,盡可能避免污染。吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌,每次吸頭用畢應(yīng)更換,不要互相污染試劑；2.加試劑前,應(yīng)短促離心10秒鐘,然后再打開管蓋,以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面；3.應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對照。注意事項實(shí)驗(yàn)三PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶影響DNA遷移速率因素DNA分子泳動主要的因素分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。1.DNA的分子大小:2.DNA分子的構(gòu)象3.瓊脂糖濃度4.電源電壓5.嵌入染料的存在6.離子強(qiáng)度影響

瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1,3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4連接的3,6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104～105的長鏈。

瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機(jī)線團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑

瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍核酸電泳緩沖液有三種Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)和Tris-磷酸(TPE).

DNA電泳上樣緩沖液

DNALoadingBuffer作用

1.螯合Mg2＋，防止電泳過程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mMEDTA。

2.增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。

3.指示劑監(jiān)測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。DNA電泳的標(biāo)準(zhǔn)分子量

目前各廠商開發(fā)了各種類型的標(biāo)準(zhǔn)分子量，有廣泛用于PCR產(chǎn)物鑒定的小分子Marker，也有常規(guī)用的大分子Marker常用的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量電泳圖二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法2通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增的目的基因儀器及耗材：天平、電泳設(shè)備、臺式離心機(jī)、稱量紙、藥勺、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、三角瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。材料：PCR產(chǎn)物試劑：瓊脂糖，1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠（EB）、6×Loadingbuffer、無菌去離子水、DNAMarker；三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟1.1g瓊脂糖加入100ml0.5×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。2.將制膠板放好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固3.充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加0.5×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。4.用移液器吸取3μl的6×loadingbuffer于封口膜上，再加入9μlDNA樣品，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。5.打開電源開關(guān)，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約30min-60min。6.在瓷盤中加入適量的水，再加入5－10μlEB，將凝膠放入盤中2－3分鐘

7.將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)，再紫外燈下檢測PCR產(chǎn)物的DNA條帶實(shí)驗(yàn)四目的基因與載體連接一、實(shí)驗(yàn)原理DNA沉淀、洗滌、融解、濃度測定和保存DNA不溶于有機(jī)溶劑，可用乙醇或異丙醇來沉淀DNA1醇的沉淀，目的是使核酸從體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽分離。2標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量沉淀DNA用70%乙醇洗滌，除去其它鹽和小分子物質(zhì)。沉淀的DNA多使用水或者低濃度緩沖液溶解如弱堿性的TE溶解。核酸質(zhì)量檢測：電泳和紫外分光光度儀核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。目的基因與載體連接平末端連接粘性末端連接T載體策略連接平末端連接TaqDNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。有些DNA聚合酶（pfuDNA聚合酶）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平端，可以直接用于平端連接粘性末端連接利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。T-載體連接TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3‘末端加一個非模板依賴堿基(A或T),所加堿基多為A。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶(如EcoRV)切割載體,使其產(chǎn)生平末端,再利用TaqDNA聚合酶向載體雙鏈DNA的3‘末端加上T,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接pMD18-TVectorpMD18-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（TACloning）的專用載體。用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3‘端添加“T”而成。，本制品中的高效連接液SolutionI可以在短時間內(nèi)（約30分鐘）完成連接反應(yīng)，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。pMD18-TVector的結(jié)構(gòu)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1通過乙醇沉淀DNA2通過T載體策略進(jìn)行目的基因與載體的連接儀器及耗材：臺式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、水浴鍋。材料：PCR產(chǎn)物試劑：無水乙醇，70%乙醇、3MNaAc（pH5.2）、無菌去離子水；pMD18-T

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟1.將PCR產(chǎn)物加去離子水至50μL,加入1/10倍體積的3MNaAc(5μL)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，－20℃放置10min;2.12,000rpm，4℃，離心10min;3.去上清，將PCR管倒置于吸水紙上；4.向PCR管加入適量70％乙醇，將DNA沉淀重懸；5.12,000rpm，4℃，離心5min;6.去上清，倒置吸水紙上，晾干，加入10μL去離子水融DNA沉淀。7.測定DNA的濃度8.沉淀的目的基因DNA與載體連接取一新的PCR管，加入下列反應(yīng)成分(總體積10μl)：

目的DNA4.5μl(0.1pmol～0.3pmol)pMD18-TVector0.5μl加入5μl（等量）的SolutionI；9.16OC水浴中反應(yīng)30分鐘。實(shí)驗(yàn)五大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備一實(shí)驗(yàn)原理

在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能憑自己的能力進(jìn)入細(xì)菌。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞制備方法化學(xué)法:CaCl2處理后細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞;物理法:大腸桿菌暴露在電荷中時，其細(xì)胞膜會不穩(wěn)定而誘導(dǎo)形成孔洞，于是DNA分子可由該孔進(jìn)入細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞制備中應(yīng)注意因素細(xì)胞生長狀態(tài)和密度不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時,細(xì)胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2.試劑的質(zhì)量所用的試劑,如CaCl2

等均需較高純度，冰箱保存。3.防止雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)以E.coliDH5α菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態(tài)；2.制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細(xì)菌投布器、三角瓶、牙簽、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計、冷凍離心機(jī)、50mL離心管、無菌工作臺材料：E.coliDH5α菌株試劑：LB固體和液體培養(yǎng)基、100mMCaCl2、甘油。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)配方：

蛋白胨(Tryptone)1g酵母提取物(Yeastextract)0.5gNaCl1g加去離子水至總體積100mL，用NaOH調(diào)pH至7.0,高壓滅菌LB固體培養(yǎng)基配方：每100mLLB液體培養(yǎng)基中加1.2g瓊脂粉,高壓滅菌。超凈工作臺離心設(shè)備臺式高速冷凍離心機(jī)恒溫空氣搖床恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿四實(shí)驗(yàn)步驟

菌株活化1．用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時；2．挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到10mlLB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時；3．將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時，到OD600＝0.45-0.55感受態(tài)細(xì)胞制備4.將30ml菌液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上10min;5.4oC，5,000rpm，離心5min；6.去上清，將沉淀重懸于10ml用冰預(yù)冷的100mMCaCl2中，置于冰上30min；7.4oC，5,000rpm，離心5min；8.去上清，將沉淀重懸于1mL用冰預(yù)冷的100mMCaCl2溶液中，再加入70%甘油至終濃度為15-20%(0.4ml),混勻；9.按每管100

l分裝，冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞，-70oC冰箱中保存.實(shí)驗(yàn)六連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌一實(shí)驗(yàn)原理

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞與重組質(zhì)粒DNA放置在冰浴(0oC)，CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)突然熱激（42oC）處理，更有利于細(xì)胞對DNA復(fù)合物的攝取，外源DNA分子通過吸附、轉(zhuǎn)入、自穩(wěn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且開始進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。

將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。ＤＮＡ分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌表面；２．轉(zhuǎn)入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解；３．自穩(wěn)－－外源質(zhì)粒ＤＮＡ分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；４．表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時復(fù)制，分裂，轉(zhuǎn)錄翻譯。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

將目的基因與質(zhì)粒的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞，為重組載體的篩選最準(zhǔn)備儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細(xì)菌投布器、三角瓶、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、無菌工作臺材料：目的基因與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞試劑：LB固體和液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素(100mg/mL)、IPTG(200mg/mL)、X-gal(20mg/mL),。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑氨芐青霉素(Amp)配置：無菌水配制氨芐青霉素成100mg/mL溶液，過濾除菌，-20oC冰箱保存；X-gal配置：將X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/mL濃度的溶液，裝于玻璃或聚丙烯管中，以錫鉑紙包裹避光保存于-20oC，X-gal不需要過濾除菌；IPTG配置：將2gIPTG溶于8mL水中，用水調(diào)節(jié)體積到10mL,過濾除菌，-20oC冰箱保存。固體LB平板的準(zhǔn)備1.固體LB培養(yǎng)基的配置：每100mL液體LB培養(yǎng)基加入1.2g瓊脂粉，pH7.0，高溫滅菌；2.固體LB培養(yǎng)基融化后，冷卻到50oC，加入氨芐青霉素（100μg/mL），再倒入滅菌的平板內(nèi)；3.在LB固體培養(yǎng)基表面均勻投布4μLIPTG(200mg/mL)和40μLx-gal(20mg/mL),吹干;四實(shí)驗(yàn)步驟4.從-70oC冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞,置冰上解凍；5.在超凈臺上，取5

l連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻，冰上放置30min；6.42oC熱激處理90sec，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；7.加入600－800

l無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37oC，50－60rpm溫育45min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；8.菌液均勻涂布到含有抗生素（Amp100

g/ml,并均勻的涂布有IPTG和X-gal）的LB平板上吹干，將培養(yǎng)皿倒置于37oC，培養(yǎng)16h；實(shí)驗(yàn)七陽性克隆的鑒定和篩選將目的基因與載體進(jìn)行連接形成重組子并轉(zhuǎn)化后，在連接產(chǎn)物中既有載體和目的基因的連接，也有載體的自連和目的基因的自連，更多的是未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片斷。這就需要我們對陽性克隆進(jìn)行鑒定和篩選，將含有外源DNA的宿主細(xì)胞和不含外源DNA的宿主細(xì)胞分開，將含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開。一實(shí)驗(yàn)原理在我們的實(shí)驗(yàn)中，目的基因與T載體(pMD18-T)連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α菌株。由于pMD18-T上帶有Ampr和lacZ基因,故重組子的篩選首先采用Amp抗性篩選與α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。pMD18-TVector的結(jié)構(gòu)因pMD18-T帶有Ampr基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pMD18-TDNA的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來（質(zhì)粒自身環(huán)化和重組載體）;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。α-互補(bǔ)

pMD18-T上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(diǎn),但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,pMD18-T和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象為-互補(bǔ)現(xiàn)象。

由互補(bǔ)產(chǎn)生的－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－

－D－半乳糖苷(X-gal)而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所以利用這個特點(diǎn)，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點(diǎn)，當(dāng)插入一個外源DNA片段時，會造成LacZ(

)基因的失活，破壞-互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過程示意圖菌落PCR鑒定陽性克隆并不是所有白斑菌落是含有重組質(zhì)粒的陽性菌落，存在假陽性現(xiàn)象。可以通過菌落PCR進(jìn)一步鑒定含有重組質(zhì)粒的陽性菌落。常規(guī)的PCR鑒定需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取等多步操作后才能進(jìn)行基因擴(kuò)增，操作繁瑣，耗時較長，為了簡化操作程序，Gussow和Clackon提出菌落PCR方法，即用無菌牙簽挑取單菌落到TE緩沖液中，煮沸5min，渦旋振蕩后短暫離心，用1－2μL裂解液作DNA模板，這樣就省去了抽提模板DNA這一步，大大節(jié)省了時間和成本。后來該方法進(jìn)一步改進(jìn)，利用牙簽直接沾取一點(diǎn)單菌落作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)更大量節(jié)省了時間，簡化了操作程序，單菌落PCR可以有效的篩選陽性重組克隆。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)通過藍(lán)白斑篩選陽性重組菌落；2.學(xué)習(xí)菌落PCR技術(shù)及通過菌落PCR鑒定白斑菌落。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、電熱恒溫培養(yǎng)箱、無菌工作臺、牙簽、PCR管、各種tip、PCR儀。材料：連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的菌落平板三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑試劑：LB液體培養(yǎng)基氨芐青霉素(100mg/mL)

10×PCR反應(yīng)緩沖液;dNTPMix(每種2.5mM);5’和3’引物（10μmM）;TaqDNA聚合酶2.5U/μl;無菌去離子水；1.用牙簽從LB固體平板上挑取白斑單菌落接種到1mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37oC，200rpm培養(yǎng)過夜；2.同時將牙簽在下如下PCR體系中攪一下(總體積25μl)ddH2O20.883.2μl10×Buffer(IncludingMgCl2)2.510μldNTPmix（各10mM）0.52μl5’上游引物（10μM）0.52μl3’下游引物（10μM）0.52μlTaqDNA聚合酶0.20.8μl可以以小組為單位，現(xiàn)將上述各試劑混合，再分裝，如小組為4人，就在EP管中加入4倍體積的上述各組分（除菌液），在分裝到PCR管，這樣便于試劑取樣。四實(shí)驗(yàn)步驟3.將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子；4.用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1分鐘,72oC延伸2分鐘,32個循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后,于72oC下保溫10分鐘；5.終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存。五注意事項1.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。3.在含有X-gal、IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。實(shí)驗(yàn)八重組質(zhì)粒的提取一、實(shí)驗(yàn)原理從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA方法包括3個基本步驟:1.培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；2.收集和裂解細(xì)胞;3.分離和純化質(zhì)粒DNA。1.細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒的擴(kuò)增與質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)和細(xì)菌個數(shù)正相關(guān)。質(zhì)?？截悢?shù)是指在正常生長條件下，每個細(xì)菌細(xì)胞所對應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。在質(zhì)粒復(fù)制子調(diào)控下，質(zhì)?？截悢?shù)可隨細(xì)菌培養(yǎng)條件變化而在較窄的范圍波動，生長條件恒定，質(zhì)粒增殖速度與宿主細(xì)胞增殖速度完全一致，拷貝數(shù)保持不變。2.細(xì)菌的收獲與裂解細(xì)菌的收獲可以通過離心來進(jìn)行；細(xì)菌的裂解可以采用多種方法，這些方法包括非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及加熱處理等。采用何種方法取決于三個因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株和裂解后用于純化質(zhì)粒DNA技術(shù)。大質(zhì)粒（＞15kb）采用溫和方法小質(zhì)粒（＜15kb）可采用較劇烈方法有些大腸桿菌菌株不能采用加熱的方法裂解；3.分離和純化質(zhì)粒DNA

當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時，細(xì)菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環(huán)狀DNA的兩條鏈不會相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。

在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時,同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1了解質(zhì)粒各種提取方法2通過堿法提取重組質(zhì)粒儀器及耗材：三角瓶、超凈工作臺、臺式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、EP管、DNA振蕩器。材料：含有重組質(zhì)粒的培養(yǎng)細(xì)菌三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑堿法提取質(zhì)粒需要的試劑：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ配制后高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1％SDS(臨用前用10mol/LNaOH和10％SDS現(xiàn)配)。溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高壓滅菌。試劑（一）、堿法1.

接種少許通過PCR鑒定含有重組質(zhì)粒DH5α菌液到液體LB培養(yǎng)基(含100μg/ml