第十章生物技術(shù)與人類健康

第十一章生物技術(shù)與人類健康基因工程疫苗基因診斷基因治療第一節(jié)基因工程疫苗1、疫苗的概念：是一類接種后能激發(fā)人體免疫反應(yīng)來抵抗某些傳染病的生物制品。作用：疫苗是一種特殊的藥物，它不是用于治療疾病，而是用于預(yù)防疾病。傳統(tǒng)疫苗滅活疫苗減毒疫苗新型疫苗基因工程疫苗核酸疫苗生物工程疫苗主要是指基因工程疫苗2、類型：1.減毒疫苗優(yōu)點(diǎn)：一般只需接種一次，接種量少，免疫持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，效果好。缺點(diǎn)：保留一定的殘余毒力，對(duì)免疫缺陷者可引起嚴(yán)重感染；個(gè)別活疫苗在應(yīng)用過程中有毒力回升現(xiàn)象；制作時(shí)，如果減毒不夠會(huì)造成被接種者嚴(yán)重感染；過度減毒又會(huì)造成免疫原性不足或喪失，失去活疫苗的作用；減毒疫苗需低溫保存和運(yùn)輸。2.滅活疫苗優(yōu)點(diǎn)：制備簡(jiǎn)單，保存時(shí)間較長(zhǎng)，相對(duì)較安全。缺點(diǎn)：免疫力較差，接種劑量較大且需多次接種。3、基因工程疫苗生產(chǎn)過程：將病原體的某個(gè)或某幾個(gè)抗原基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，進(jìn)行表達(dá)，獲得的表達(dá)產(chǎn)物就可以作為疫苗。優(yōu)點(diǎn)：可刪除細(xì)菌和病毒中抗原物質(zhì)的基因或基因片斷。開展基因工程疫苗的研究開發(fā)的原則和對(duì)策(1)不能或難于培養(yǎng)的的病原體如乙型肝炎病毒(HBV)，EB病毒(Epstein-Barr病毒，EBV)，巨細(xì)胞病毒(CMV)，人乳頭瘤病毒(HPV)，麻風(fēng)桿菌，疾原蟲、血吸蟲等。(2)有潛在致癌性或免疫病理作用的病原體，前者如1型嗜人T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-I)，人免疫缺損病毒(HIV),單純皰疹病毒(HSV)等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革熱病毒(DGV)，腎綜合征出血熱病毒(HFRSV)；(3)常規(guī)疫苗免疫效果差，如霍亂和痢疾菌苗；或者反應(yīng)大，如百日咳和傷寒菌苗。(4)能大大節(jié)約成本，簡(jiǎn)化免疫程序的多價(jià)疫苗，如以痘苗病毒，腺病毒，卡介苗或沙門氏菌為載體的多價(jià)活疫菌；

種類基因工程多肽或亞單位疫苗基因修飾減毒活疫苗基因重組活疫苗和多價(jià)活疫苗

基因工程多肽或亞單位疫苗使人體對(duì)微生物具保護(hù)作用的抗原基因經(jīng)體外重組表達(dá)后所制備的生物活性多肽類疫苗稱基因工程多肽或亞單位疫苗。其表達(dá)系統(tǒng)可以是酵母，也可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞?；蛐揎棞p毒活疫苗包括基因重組減毒活疫苗和基因缺失減毒活疫苗?；蛑亟M減毒活疫苗適應(yīng)于分節(jié)段的病毒基因組如流感，輪狀病毒和腎綜合征出血熱病毒，其原理是通過將野生型病毒表面抗原基因與疫苗株或弱毒株病毒的基因組通基因重組后可獲得減毒活疫苗?；蛉笔p毒活疫苗是使病原體基因組中與毒力相關(guān)的基因造成缺失，這種缺失株的減毒活疫苗可避免常規(guī)減毒活疫苗的返祖復(fù)毒株的產(chǎn)生。如狂犬病毒發(fā)生TK缺失（第一代），再發(fā)生gp3區(qū)缺失（第二代）HSV-1的α22缺失?；蛑亟M活疫苗和多價(jià)活疫苗其原理是將外源性目的基因(保護(hù)性抗原基因)插入已知的病毒或細(xì)菌的弱毒株或疫苗株的基因組中至使目的基因獲高效表達(dá)，但不影響原弱毒株或疫苗株的生存與繁殖。接種了這種重組疫苗以后，體內(nèi)除了可獲得針對(duì)原疫苗株的免疫保護(hù)之外，還可獲得插入目的基因?qū)ο嚓P(guān)疾病的保護(hù)力，目前應(yīng)用最多的載體為以牛痘苗病毒為載體同時(shí)插入和表達(dá)了多種病毒的保護(hù)性抗原基因，如HAV、HBV，麻疹病毒，Ⅰ型和Ⅱ型HSV、EBV、狂犬病毒等。此外還有用腺病毒/脊灰病毒/輪狀病毒/傷寒Tyzla株/鼠傷寒沙門氏菌/株載體核酸疫苗核酸疫苗（NucleicAcidVaccines）是控制感染因子的一種新型疫苗，包括DNA和RNA疫苗。通過DNA重組技術(shù)把編碼病原體保護(hù)性抗原的基因克隆入真核表達(dá)載體中。構(gòu)建核酸疫苗的載體主要有重組質(zhì)粒型載體和病毒載體（包括逆轉(zhuǎn)錄病毒）。尤以前者較多。重組了目的基因的質(zhì)粒經(jīng)細(xì)菌擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒DNA并加以純化，即可制成核酸疫苗用于免疫接種。進(jìn)入機(jī)體的核酸疫苗不與宿主細(xì)胞染色體整合，但它能夠表達(dá)保護(hù)性抗原蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，進(jìn)而使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗感染免疫力。

第二節(jié)基因診斷

一、基因診斷的概念及常用技術(shù)患者臨床表現(xiàn)：中醫(yī)的望聞問切與西醫(yī)的影像學(xué)檢查細(xì)胞形態(tài)、生化檢測(cè)及免疫學(xué)檢驗(yàn)：生命活動(dòng)的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)基礎(chǔ)

基因診斷的出現(xiàn)：1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家KanYW用核酸分子雜交首次對(duì)一例α珠蛋白生成障礙性貧血進(jìn)行診斷

狹義:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸雜交、基因重組、基因芯片等各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)特定基因存在與否、結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)的過程，對(duì)疾病作出診斷。

基因診斷的概念與傳統(tǒng)診斷的區(qū)別：直接以病理基因（致病基因、疾病相關(guān)基因和外源性病原生物基因等）為分析對(duì)象，即對(duì)待診生物材料某一（些）特定基因進(jìn)行分析判斷。Essentialbasisofgenediagnosis遺傳物質(zhì)改變：一是DNA或RNA水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達(dá)水平從低到高等；二是基因結(jié)構(gòu)變化即突變，如點(diǎn)突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活等。核酸分子雜交和PCR擴(kuò)增是基因診斷的基本技術(shù)

核酸雜交的基本過程：PreparationofSamplesandProbesPrehybridizationandHybridizationDetectionandAnalysisoftheResult1.制備合適的探針是核酸雜交用于基因診斷的關(guān)鍵Whatisaprobe?標(biāo)記的已知序列核酸片段，包括DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide針對(duì)具體情況選擇合適的探針序列是基因診斷準(zhǔn)確、特異、簡(jiǎn)便、可靠的基礎(chǔ)。2.不同形式的核酸分子雜交可用于不同的診斷目的Southernblot:DNANorthernblot:RNAFISH:fluorescenceinsituhybridization（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

PCR原理示意圖

PCR是在試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行同一段DNA片段合成的過程

PCR在基因診斷中的作用

從極少樣品即可擴(kuò)增出肉眼可見的產(chǎn)物。放大待診信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度

PCR及其衍生技術(shù)直接運(yùn)用PCR擴(kuò)增：異常缺失與存在PCR產(chǎn)物的限制性酶譜分析（PCR-RE)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP)RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism

PCR及其衍生技術(shù)PCR－RFLP：通過PCR將包含待測(cè)位點(diǎn)的DNA片段擴(kuò)增后，用識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶水解，根據(jù)所產(chǎn)生限制性片段的數(shù)量和長(zhǎng)度作出診斷。用于已知突變位點(diǎn)的驗(yàn)證性診斷

（三）DNA序列測(cè)定是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷技術(shù)病例SOX9基因HMGbox內(nèi)發(fā)生單堿基置換突變R178L(G→T)，如圖2所示，左側(cè)正常對(duì)照第225位堿基為C，而該患兒為A（反義鏈中）

例：序列分析用于基因診斷研究（四）DNA芯片技術(shù)是應(yīng)用前景廣闊的基因診斷技術(shù)（DNAchips)生物芯片（biochip&bioarray)技術(shù)：根據(jù)生物分子間特異性相互作用，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等各種生物成分的高通量快速檢測(cè)分析。疾病診斷芯片個(gè)性化用藥芯片例：基因芯片雜交結(jié)果基因診斷有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)高特異性：診斷目標(biāo)高靈敏度：分子生物學(xué)方法結(jié)果穩(wěn)定可靠：核酸的化學(xué)本質(zhì)早期診斷性：分子遺傳學(xué)規(guī)律應(yīng)用廣泛性：疾病與非疾病檢查基因診斷技術(shù)途徑：①直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常的直接診斷途徑；②利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析的間接診斷途徑。二遺傳病的基因診斷直接診斷：檢測(cè)已知致病基因必要條件①被檢基因的突變類型與疾病發(fā)病有直接的因果關(guān)系：②被檢基因的正常分子結(jié)構(gòu)已被確定；③被檢基因突變位點(diǎn)固定而且已知。1.點(diǎn)突變：（1）導(dǎo)致特異性限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)改變

（2）無限制性酶切位點(diǎn)改變直接診斷：檢測(cè)已知致病基因在DNA序列上有較長(zhǎng)一段序列的重新排布。包括大片段（數(shù)十個(gè)堿基甚至數(shù)千個(gè)堿基）的丟失、插入、取代、復(fù)制放大和倒位等，這些突變進(jìn)而引起更大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)上的改變從而影響多個(gè)基因的功能，即染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等2.基因重排：核酸分子探針雜交與PCR

（1）Southern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交，通過設(shè)計(jì)一系列相應(yīng)于缺失區(qū)域的核苷酸探針，正常者出現(xiàn)雜交信號(hào)，而患者則因缺失這一區(qū)域，而檢測(cè)不到雜交信號(hào)（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技術(shù)成功地同時(shí)擴(kuò)增了人類杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的多個(gè)基因座

3.基因表達(dá)異常mRNA的相對(duì)定量分析mRNA的絕對(duì)定量分析

mRNA長(zhǎng)度分析間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志DNA多態(tài)性：指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型，即個(gè)體間同一染色體的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差異或變異。多態(tài)性在人群中出現(xiàn)的頻率應(yīng)大于1%（如小于1%常認(rèn)為是異常突變）。在生物進(jìn)化過程中形成的，它本身并不致病或于遺傳病有直接聯(lián)系，故稱為“中性突變”。人類的23對(duì)染色體中，每一條上都帶有許多遺傳多態(tài)性位點(diǎn)，其中一些位點(diǎn)在染色體上的位置與致病基因靠的很近，甚至連鎖在一起遺傳，并且呈孟德爾式遺傳。因此，可利用這一多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳指示標(biāo)記。

人為什么長(zhǎng)腫瘤物種的進(jìn)化建立在基因突變的基礎(chǔ)之上，但是這必然也可能帶來副產(chǎn)品：人類惡性腫瘤的生長(zhǎng)。這是人類進(jìn)化必然要付出的代價(jià)。

我們要想根絕腫瘤，是不可能的。腫瘤發(fā)生是生物衰老在基因水平的機(jī)理之一，自然界不可能讓一個(gè)生物長(zhǎng)生不死，生生不息。人的免疫功能減退，出現(xiàn)腫瘤，然后死亡，這是自然界宏觀的平衡調(diào)控機(jī)制起作用的結(jié)果，包含進(jìn)化方面的積極意義，這就是為什么自然界要讓人類長(zhǎng)腫瘤的原因。

三腫瘤的基因診斷當(dāng)前的一個(gè)誤區(qū)是對(duì)腫瘤過于偏激，聞癌色變，片面地把它當(dāng)作深惡痛絕的東西，導(dǎo)致治療上的誤區(qū)：想盡辦法去殺死它。利用放、化療技術(shù)殺死腫瘤細(xì)胞，結(jié)果把體內(nèi)很多良性細(xì)胞也殺死了。把80歲前病故的人都做一遍尸解，就會(huì)發(fā)現(xiàn)100%的人體內(nèi)都有腫瘤；人如果活到120歲，體內(nèi)會(huì)有3到4個(gè)惡性腫瘤，但不影響生活質(zhì)量。許多人不知道自己患有腫瘤，所以沒有精神恐懼和巨大的壓力。

70、80歲以后長(zhǎng)腫瘤，屬生理現(xiàn)象，很正常；70歲以前長(zhǎng)腫瘤則是是病理性的

腫瘤的危險(xiǎn)主要在于發(fā)現(xiàn)得太晚，一旦發(fā)現(xiàn)就難以治愈，這樣給人們?cè)斐闪藰O大的恐懼。積極的做法應(yīng)當(dāng)是設(shè)法認(rèn)識(shí)腫瘤，不要讓它出現(xiàn)太早，盡量延緩其出現(xiàn)和生長(zhǎng)，有效地控制它。

腫瘤基因診斷的內(nèi)容基礎(chǔ)：腫瘤發(fā)病分子機(jī)制深入探索臨床：早期及預(yù)警診斷易感性評(píng)估及監(jiān)測(cè)腫瘤的鑒別、分級(jí)、分期及預(yù)后輔助治療方案確定療效監(jiān)測(cè)及評(píng)估策略一：易位染色體和融合基因檢測(cè)

如T細(xì)胞受體基因TCR與IgH重排后，原先間隔數(shù)百bp的V區(qū)和J區(qū)靠近，通過擴(kuò)增片段長(zhǎng)度判斷是否重排策略二：癌基因和抑癌基因檢測(cè)

如原癌基因K-ras第12、13和61位密碼子點(diǎn)突變：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT；抑癌基因p53密碼子130～290之間的基因突變

策略三：病毒癌基因檢測(cè)

多種DNA或RNA病毒感染與腫瘤相關(guān)策略四：腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)

tumormarker:腫瘤組織產(chǎn)生的、與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的物質(zhì)，如腫瘤抗原、激素、酶等?；蛑委煼诸愺w細(xì)胞(somaticcell)基因治療生殖細(xì)胞(germline)基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代第三節(jié)基因治療一、基因治療的策略二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

四、治療基因的受控表達(dá)三、基因干預(yù)五、基因治療的應(yīng)用研究

一、基因治療的策略基因治療的概念定義：將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)疾病起治療作用。

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正常基因置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。又稱為基因打靶(genetargeting）定點(diǎn)整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實(shí)現(xiàn)?；蛲粗亟M技術(shù)要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達(dá)1/10。（二）基因添加

基因添加或稱基因增補(bǔ)（geneaugmentation）:通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型:在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。（三）基因干預(yù)基因干預(yù)（geneinterference）:采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。（四）自殺基因治療自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤