第五章 分子生物學(xué)常用技術(shù)2

PCR技術(shù)

PCR(PolymeraseChainReaction)Threesteps:denaturation,primerannealing,polymerization.ThePCRcycle95CsteptodenaturetheduplexDNA,Anannealingstepofaround55Ctoallowtheprimerstobind,72Cpolymerizationstep.Mg2+,dNTPsarerequiredinadditiontotemplate,primers,bufferandenzyme歷史60s-70s：基因的體外分離技術(shù)。Khorana（1971）：美國MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想遺忘:當(dāng)時很難進(jìn)行測序和合成寡核苷酸引物；當(dāng)時(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能KaryMullis(1985)發(fā)明過程

Mullis在“偶然想出的聚合酶鏈反應(yīng)”一文中寫到:“這種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時想出來的”。發(fā)展過程：

開始使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，該酶不耐熱，每次加熱變性DNA后都要重新補(bǔ)加。耗時、費(fèi)力、易出錯。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得自動化。專利官司1987年美國專利局專利授權(quán)1989年，DuPont異議，大小公司對簿公堂，將決定誰將獲得諾貝爾獎。DuPont理由是，1971年P(guān)CR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應(yīng)當(dāng)是公共產(chǎn)權(quán)。斯坦福大學(xué)Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎）也認(rèn)為，任何具備生物技術(shù)知識的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。美國專利局駁回DuPont異議，地方法院判屬CetusCetus獲勝后馬上反訴，指出DuPont已侵犯另一項(xiàng)與PCR有關(guān)的專利并要求對方賠償以及不再銷售與PCR有關(guān)試劑和儀器PCR發(fā)展速度驚人，沒有一種技術(shù)能與之相比引用論文最多、應(yīng)用范圍十分廣泛1993年度諾貝爾化學(xué)獎：Mullis，與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變”加拿大籍英國科學(xué)家MichaelSmith共獲

原理

類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。procedurestemplate(DNAorRNA),primers,Taqenzyme,10×PCRbuffer,Mg++,5mmol/LdNTPspre-denaturation--denaturecompletelyDenaturationannealingElongationcycles:25-30PrimerdesignMostimp.(1)length:20～30bp(2)G+Ccontents:ATCGrandomdistributed(3)primers:nocomplementarysequence(4)3‘endoftheprimer:nomodification(5)5‘endoftheprimer:productlength，canbemodified(6)specificity:lessthan70%homologywithnon-specificamplificationsequence,or8bpcontinuouscomplementarybasePrimerdesignedwiththehelpofcomputerDNAdatabaseconservativeregioncomparisionprimersorblast

PCRreactioncomponentsandtheirfunctionstemplate：ssDNA,dsDNAmRNAneededtobeRTascDNAsamples：fromblood,spermoranyothertissue,fromolderforensicspecimens,fromancientbiologicalsamplesorinthelab.Frombacterialcoloniesorphageplaques.DNA：verystableprimesIfthePCRproductistobecloned,itissensibletoincludethesequenceofuniquerestrictionenzymesiteswithinthe5’-endsoftheprimers.Canamplifyfragmentsover10kbinlengthStore:純化引物在25％乙腈溶液中4℃；凍干引物于-20℃可保存1-2年，液體狀態(tài)于-20℃可保存6個月。不用時應(yīng)-20℃保存。buffer10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。Mg2+：for

Taqpolymeraseactivityconc.:Low:lowactivityhigh:non-specificamplificationdNTPs：貯備dNTP液：1mol/LNaOH調(diào)pH至中性。貯備濃度為5-10mmol/L，終濃度為20-200umol/L，分裝-20℃保存。4種dNTP濃度應(yīng)相同。TaqDNApolymerase：fromthermophilicbacteria.TaqpolymerasefromThermusaquaticus.otherthermostableDNApolymerasewithgreateraccuracyusedforcertainapplications.mineraloilSelectionforDNApolymeraseKlenow酶早期采用該酶不耐熱，缺點(diǎn)有①溫度要求低(37℃)，受熱即失活；②產(chǎn)物特異性不高；③積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低；④擴(kuò)增的最長序列約400bp（Taq酶則能擴(kuò)增10kb）thermostableDNApolymerases①TaqDNApolymerase②TthDNApolymerase—fromT.thermophilus③VENTDNApolymerase—fromT.litoralis④Sacpolymerase⑤pfupolymeraseTaqDNA聚合酶分離:1969年，美國黃石國家公園溫泉分子量:94KDa活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200000U/mgTaqDNA聚合酶離子需要：對Mg2+、單價離子性質(zhì)和濃度較敏感。最適濃度為50mmol/L。忠實(shí)性:沒有校正單核苷酸錯配功能--致命弱點(diǎn)。一般出錯率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測序時尤應(yīng)注意。TaqDNA聚合酶抑制劑:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及許多其他化學(xué)藥劑。內(nèi)源DNA:不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細(xì)菌DNA或PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來源的DNA。在使用擴(kuò)增保守序列的通用引物時，會在無模板對照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。保存:在-20℃至少6個月。PCRoptimization變性溫度和時間92-95℃，富含G和C的序列，可適當(dāng)提高，但過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。退火溫度與時間引物中G、C含量高、長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-55℃、1-2分鐘。延伸溫度和時間溫度：72℃，接近Taq酶的最適75℃時間：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時間。循環(huán)次數(shù)循環(huán)過多，非特異性產(chǎn)物大量增加PCR污染及其對策強(qiáng)大擴(kuò)增能力+檢測的敏感性極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性污染源的追蹤①點(diǎn)樣器和加樣器;②離心機(jī);③微解剖刀;④濃縮用具、真空瓶;⑤電泳裝置;⑥紫外燈箱;⑦乙醇或水浴鍋;⑧冰箱門把手、實(shí)驗(yàn)臺面等污染的預(yù)防隔離不同操作區(qū)分裝試劑改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作專用加樣器(5)結(jié)果的重演PCR技術(shù)的應(yīng)用遺傳性疾病地中海貧血的基因診斷血友病苯丙酮尿癥傳染性疾病肝炎性病腫瘤法醫(yī)學(xué)個人識別、親子鑒定1985年，英國遺傳學(xué)家Jeffreys采用DNA指紋圖譜進(jìn)行個人識別和親子鑒定。有時犯罪物證量很少，不足以用來進(jìn)行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問題。對于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學(xué)上認(rèn)證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術(shù)被普遍采用。植物遺傳育種構(gòu)建遺傳圖譜、分離目的基因、基因定位分子標(biāo)記輔助育種了解不同品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化畜牧畜禽病診斷:豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹瀉病毒、免疫缺陷病毒等檢測性別鑒定：牛、綿羊Y染色體上特異DNA片段構(gòu)建基因圖譜檢測基因整合與表達(dá)：轉(zhuǎn)基因魚其他①考古學(xué)②植物分類學(xué)③群體生態(tài)學(xué)DNA芯片技術(shù)

第一小節(jié)概述

一、DNA芯片技術(shù)的概念

DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（insitusynthesis）寡核苷酸探針，或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。由于常用計算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。DNA芯片又被稱為基因芯片（genechips）、DNA陣列（DNAarray）、cDNA芯片（cDNAchips）、寡核苷酸陣列（oligonucleotidearray）等。二、DNA芯片的主要類型及其特點(diǎn)。

根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類：原位合成芯片（syntheticgenechip）采用顯微光蝕刻等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片。這種芯片的集成度教高，可達(dá)10萬～40萬點(diǎn)陣/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長度較短，一般為8～20個核苷酸殘基（nucleotide，nt），最長為50nt，因此需要使用多個相互重疊的探針片進(jìn)行檢測，才能對基因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

DNA微集芯片（DNAmicrochips）將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為DNA微集芯片，又稱為DNA微集陳列（DNAmicroarray）。這類芯片集成度相對較低，可達(dá)1萬～10萬點(diǎn)陣/平方厘米，但使用的探針組的來源比較靈活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用來自基因組的較長的DNA片段；可以是雙鏈，也可以采用單鏈的DNA或RNA片段，且技術(shù)實(shí)現(xiàn)未受到嚴(yán)格的專利控制，因而近年來發(fā)展很快。探針的長度可達(dá)100～500nt。第二節(jié)DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法一、芯片的制備芯片制備的基本原理。芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的準(zhǔn)備和DNA微集陳列的制備三個方面。1.支持物的預(yù)處理目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實(shí)性材料和膜性材料。實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實(shí)性材料需要進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團(tuán)。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的光敏保護(hù)基團(tuán)形成共價交聯(lián)而被保護(hù)起來，合成時在光照下除去光敏保護(hù)基團(tuán)，該活性基團(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。另一方面，這些活性基團(tuán)可與DNA分子中的羥基等基團(tuán)形成共價結(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的DNA探針。2.原位合成芯片的制備原位合成芯片是采用顯微光蝕刻（photolithography）技術(shù)或壓電打?。╬iezoelectricprinting）技術(shù)，在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技術(shù)也稱為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（light-directedsynthesis），它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸，多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)相似，所用的技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。

3.DNA微集陳列的制備DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式。二、樣品的準(zhǔn)備樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記等過程。1．樣品的分離純化主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA，這個過程包括細(xì)胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過程。2．樣品的擴(kuò)增測定時往往需要較多的樣品分子，因此對于分離獲得的基因組DNA通過PCR技術(shù)直接擴(kuò)增，對于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。

3.樣品的標(biāo)記標(biāo)記物主要有熒光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。帶有標(biāo)記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通過DNA或cDNA擴(kuò)增的過程，摻入靶分子序列。也可以在制備引物時，摻入標(biāo)記的核苷酸，擴(kuò)增靶序列后，使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢測同位素標(biāo)記的樣品。

樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量影響芯片檢測的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。熒光標(biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)記，而且可以采用雙色，如對照樣品標(biāo)紅色，待檢樣品標(biāo)綠色，有助于結(jié)果分析與判斷。三、分子雜交芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測樣品（靶序列）與固定在載體表面的探針進(jìn)行的復(fù)雜過程。依據(jù)探針長度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時間。通常采用的條件是：42℃，50%甲酰胺，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt試劑。也可采用65℃，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt試劑或者65℃，10%SDS，7%PEG-800。雜交過程類似Northern或Southern雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、干燥與檢測。

四、檢測分析芯片雜交信號的檢測可應(yīng)用熒光檢測法、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法以及生物傳感器法。其中激光共聚焦熒光檢測法是最常應(yīng)用的方法：激光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用面，與探針雜交的靶序列標(biāo)記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，經(jīng)過棱鏡聚焦而被檢測器檢測。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配對雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號，不完全雜交顯示較弱的信號。第三節(jié)DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用DNA芯片使用的基本流程。DNA芯片使用包括待測樣品準(zhǔn)備、分子雜交和檢測分析3個步驟。1.待測樣品的準(zhǔn)備

樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記。首先采用常規(guī)方法從組織細(xì)胞中分離純化樣品核酸、DNA或mRNA，由于目前芯片檢測儀器的靈敏度有限，要求對樣品中靶序列進(jìn)行高效而特異地擴(kuò)增。樣品的標(biāo)記主要采用熒光法，也可以用生物素，放射性核素標(biāo)記法。2.分子雜交

待測樣品經(jīng)擴(kuò)增和標(biāo)記處理后，即可與DNA芯片上的探針陳列進(jìn)行分子雜交。芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類似，屬固-液雜交。探針分子固定于芯片表面，與位于液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。芯片雜交的特點(diǎn)是探針的量顯著大于靶基因片段，雜交動力學(xué)呈線形關(guān)系。雜交信號的強(qiáng)弱與樣品中靶基因的量成正相關(guān)。

3.檢測分析芯片雜交及清洗后，未雜交分子被清除，帶有熒光標(biāo)記的靶DNA（雜交分子）與其互補(bǔ)的DNA探針形成雜交體，在激光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光。以掃描儀對熒光信號進(jìn)行檢測和分析，通過陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來。

DNA芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用DNA芯片用于基因診斷、DNA序列測定、臨床藥物篩選、法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測等方面。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的潛力。1.基因診斷應(yīng)用DNA芯片技術(shù)可以在DNA水平檢測與疾病相關(guān)的內(nèi)源性或外源性基因；應(yīng)用表達(dá)芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的發(fā)育階段，正常及病理狀態(tài)基因表達(dá)的差異，也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀態(tài)下表達(dá)的差異，從而為疾病診斷與分類，病原微生物分型提供科學(xué)依據(jù)。2.DNA序列測定任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解成一系列堿基數(shù)固定、錯落而且重疊的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五個錯開1個堿基但是可重疊7個堿基的8體亞序列，當(dāng)然也可以分解成7體，9體或其他整數(shù)（n體）亞序列。如果用某種方法將5個亞序列全部測定出來，就可以重新組建原來的核苷酸排列順序。應(yīng)用這一原理，可以合成或應(yīng)用已知序列的所有可能的n體寡核苷酸，并將其固定在芯片表面，然后與標(biāo)記的待測靶序列雜交，經(jīng)過重新組合，即可得到待測的DNA序列。3.臨床藥物篩選臨床許多細(xì)菌對藥物具有抗藥性，但是不同的亞型對同一藥物的敏感性不同。DNA芯片技術(shù)已被用于鑒定結(jié)核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利福平的相關(guān)性以及HIV產(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相關(guān)性。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段。4.其他領(lǐng)域法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測等方面，DNA芯片技術(shù)也將具有極大的潛力。核酸分子雜交技術(shù)

第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理

具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。

變性復(fù)性DNA-DNA雜交雙鏈分子一、DNA變性與復(fù)性

（一）DNA變性1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3、變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加4、GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3（二）復(fù)性1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子

二、影響雜交的因素1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過高影響雜交效率2、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃3、離子強(qiáng)度：（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交

5、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DN