實驗室落菌的種類

實驗室落菌種類摘要：歸納了組織培養(yǎng)中污染原因及不同污染原因所造成的表觀現(xiàn)象，并概括了解決外植體引發(fā)污染的方法。發(fā)現(xiàn)棒桿菌屬(Corynebac2terium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococus)、地霉屬(Geotrichum)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)、根霉屬(Rhizopus)等常見的細(xì)菌和真菌是引起組培苗嚴(yán)重污染的主要菌類。取樣測試鑒定表明,大部分的微生物來源于無菌接種室內(nèi)的空氣、超凈工作臺鼓風(fēng)機排出的氣體。研究了殼聚糖對該菌的抑制作用，探索了3種分子量及其6種濃度的殼聚糖對該菌的抑制效果。殼聚糖對該污染菌有抑制作用，5萬和25萬分子量的抑菌效果高于3000分子量，濃度越高，抑菌效果越好。初步證實了殼聚糖對組培污染菌類有很好的抑制作用，在花卉組織培養(yǎng)污染防治方面具有應(yīng)用價值。關(guān)鍵詞植物組織培養(yǎng);污染;外植體;滅菌組織培養(yǎng)；污染；殼聚糖；抑制作用從德國植物生理學(xué)家Haberlandtl902年提出設(shè)想到現(xiàn)在，植物組織培養(yǎng)的研究已有100多年的歷史，近幾十年來植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展最為迅速。然而植物組織培養(yǎng)一些技術(shù)環(huán)節(jié)仍然存在不少問題，其中污染、褐化、玻璃化被認(rèn)為是組織培養(yǎng)的三大殺手。與褐化、玻璃化相比污染更易發(fā)生,給科研和生產(chǎn)實踐帶來巨大的危害。因此采取有效的防控措施，降低污染發(fā)生的機率，是組織培養(yǎng)成功的重要保障。在眾多污染途徑中，外植體攜帶微生物污染組織培養(yǎng)是最常見且不易解決的問題。筆者通過對相關(guān)文獻的分析，并結(jié)合實踐，歸納了組織培養(yǎng)過程中引起污染的原因及各種污染的表觀現(xiàn)象,提出解決外植體引發(fā)污染的措施。1污染的原因及其表觀現(xiàn)象污染就是在組織培養(yǎng)過程中微生物進入培養(yǎng)體系，在外植體上、外植體周圍的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基的其他部位生長。由于植物組織培養(yǎng)過程中的溫度、濕度、營養(yǎng)、pH值等適宜微生物的生長，因此一旦微生物進入培養(yǎng)容器中就將快速繁殖，通過營養(yǎng)競爭、侵蝕植物材料、分泌有毒代謝產(chǎn)物等途徑使植物材料發(fā)生病害或死亡，造成組織培養(yǎng)的失敗。造成污染最常見的微生物是細(xì)菌和霉菌，有時也可以是酵母菌。主要細(xì)菌有:棒桿菌屬(Corynebacterium)、腸桿菌屬(Enterobac2ter)、葡萄球菌(Staphylococus);主要霉菌有：地霉屬(Geotrichum)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)等(周俊輝等,2002)。造成污染的原因很多，從時間角度可以將污染發(fā)生原因歸納為3個階段：①前期準(zhǔn)備階段。包括培養(yǎng)基滅菌不徹底、器皿的滅菌不完全，外植體的選擇不當(dāng)與消毒不徹底；②無菌操作階段。包括無菌操作室滅菌和超凈工作臺有問題，操作不規(guī)范，操作工具的消毒不徹底等；③培養(yǎng)階段。培養(yǎng)環(huán)境不清潔和培養(yǎng)體系意外開放等。組織培養(yǎng)中，是否污染通常通過觀察培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基是否出現(xiàn)菌落來判斷。不同成因造成的污染表觀現(xiàn)象大多存在差異。通過對同批培養(yǎng)材料的菌落位置、菌落數(shù)、出現(xiàn)時間的觀察,即可初步判斷出污染的原因。例如，對于培養(yǎng)階段中的污染，雖然發(fā)生時間不確定，但是組織培養(yǎng)周期一般在30d左右，因此在前2?3d污染發(fā)生的概率比此后的概率低得多，一般在培養(yǎng)較長時間后才觀察到菌落的出現(xiàn);而超凈工作臺或操作人員導(dǎo)致的污染則在培養(yǎng)幾天后即可觀察到，因此可以根據(jù)不同的污染表觀現(xiàn)象尋找到污染的成因(表1)。污欒原囚單■牛容器出現(xiàn)|吋間陽冋抵塔捋污染情呪細(xì)菌真曲待染iHi數(shù)發(fā)4：時削培養(yǎng)基培弄■基忠面和尚那劇1-23-5問時艸植協(xié)井生ar外植休周圍1個或兒個1-23-5冋時艸植休內(nèi)生ar外植休周圍1牛威兒個丹艮陽接帥器貝外植休表面或近周1個或兒個1-23-5少數(shù)冋時趙凈冊件人員外植林財1個1-2.3-5少數(shù)冋時培拆階段外植牀以外1個3d廈陽少數(shù)案1用冋污染匝因的表觀現(xiàn)彙需要說明的是表1中的判斷標(biāo)準(zhǔn)并不是絕對的。例如,1個外植體帶入的污染可能不只是1個菌體而是多個菌體，會形成多個菌落，但最后菌落相連,表現(xiàn)為1個菌苔;有時污染是幾個原因疊加的結(jié)果,所以表觀現(xiàn)象會比表中所列出的現(xiàn)象復(fù)雜得多。2外植體消毒2.1選擇好外植體外植體也就是組織培養(yǎng)的材料。外植體表面和內(nèi)部常攜帶一些微生物,是組織培養(yǎng)過程的主要污體表面和內(nèi)部常攜帶一些微生物，是組織培養(yǎng)過程的主要污染源，外植體污染也是組織培養(yǎng)中眾多污染途徑中最難解決的一個。為了減少外植體導(dǎo)致的污染，應(yīng)該選取合適的材料，盡可能選取帶菌少以及不攜帶內(nèi)生菌的外植體。①選取胚和無病害的莖尖等，減少攜帶內(nèi)生菌的機率；②不同季節(jié)外植的帶菌情況不同，選擇適合的季節(jié)采集外植體,可以減少污染；③將有土栽培改為無土栽培，減少植物攜帶微生物的機率；④將室外的植株在移栽入清潔的室內(nèi)，生長一段時間后,再取外植體。2.2選擇合適的消毒方法對于大多數(shù)外植體只需要進行表面消毒即可，而有些外植體由于具有內(nèi)生菌，為達到較好的滅菌效果除需要進行表面消毒外還需要其他處理。2.2.1對外植體表面滅菌。外植體表面滅菌的關(guān)鍵是選擇合適的消毒劑和消毒時間。因為消毒劑不僅殺滅微生物,也對外植體產(chǎn)生一定的傷害。例如氯化汞的殺菌能力最強，最為常用,但它對外植體的傷害也最大，不易去除。不同植物或同一植物不同外植體消毒的方法是不同的，為達到滿意的滅菌效果，需要根據(jù)外植體的情況,選擇合適的消毒劑,摸索出合理的消毒時間(表2)。消毒劑的種類和消毒時間的長短并不局限于表2所列，如焦立為等(2002)用臭氧對橡皮樹帶有頂芽的葉片進行消毒，結(jié)果表明，臭氧用于外植體消毒滅菌的效果很好，接種20d后，污染率為0%,且頂芽(有鱗葉包被)接種后的成活率極高;AbdulQayyumRao等(2006)采用0.1%HgC12對棉花種子表面消毒時,采用較長的滅菌時間，種子在消毒液中浸泡20min,超出表2中的時間范圍，但不會對種子造成傷害。外植體的表面滅菌中，常用的消毒劑使用方法有：①單一消毒劑滅菌。即只用1種消毒劑對外植體進行消毒；②聯(lián)合消毒劑滅菌。使用1消毒劑對外植體消毒一段時間后，再將外植體轉(zhuǎn)入另一種消毒劑中進行消毒，最常見的聯(lián)合消毒劑滅菌是使用酒精一升汞和酒精一次氯酸鈉；③混合消毒劑滅菌。就是將2種或幾種消毒液混合后,對外植體進行消毒；④聯(lián)合與混合并用。劉香玲等(2005)在進行水稻組織時，使用混合消毒劑對水稻種子進行滅菌，將水稻種子去殼后，先用70%酒精消毒1min，再用0.1%升汞和2%NaClO(1:1)的混合消毒液浸泡20min。2.2.2對攜帶內(nèi)生菌的外植體消毒。對于容易攜帶內(nèi)生菌的外植體消毒要比表面消毒復(fù)雜得多。主要方法：①在外植體表面消毒前，采用超聲波、熱擊等物理方法處理后再進行表面消毒。例如,G.M.G.M.Hol等(1992)以水仙的鱗莖為外植體進行組培時發(fā)現(xiàn)，采用1%的次氯酸鈉對其進行滅菌時，當(dāng)滅菌時間為30min時，污染率為40%?60%;將滅菌時間延長為2h甚至4h后，仍然不能降低污染率;而在使用消毒劑前用熱水浸泡,可以將污染率降低到5%。②在消毒液中添加表面吸附劑吐溫20。任敬民等(2004)在對臺灣青棗組織培養(yǎng)的消毒方法的研究中發(fā)現(xiàn)在0.1%升汞中加入3?5滴吐溫20的消毒效果要優(yōu)于不添加吐溫20的消毒效果。③在培養(yǎng)基中添加抗生素來防止污染。鄭永強等(2003)在生姜組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，在初代培養(yǎng)時采用剝離至莖尖僅剩3?4葉原基進行表面消毒后，接種于含25?50mg/L的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素混合液防止污染效果較好，在繼代培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中抗生素濃度達25?50mg/L,污染的培養(yǎng)基基本表現(xiàn)無菌狀態(tài)。在使用抗生素時要有針對性地選擇抗生素的種類和使用濃度，一種抗生素可能只對1種或幾種微生物有效;濃度低了效果差而濃度高又容易對植物產(chǎn)生毒害(周俊輝等,2003)o對于污染嚴(yán)重的并且尚不能摸索出有效滅菌方法的外植體，在組織培養(yǎng)中,盡可能減少單位培養(yǎng)容器中外植體的個數(shù)，每個培養(yǎng)容器中可以只接入一個外植體，這樣可以獲得相對大的無污染率3結(jié)束語組織培養(yǎng)中污染的發(fā)生是極其普遍的。如何有效的防治污染，成為組培工作的重點。筆者通過實踐發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)由不同成因造成的污染，其表觀現(xiàn)象是有區(qū)別的，將污染后的表觀現(xiàn)象與造成污染的原因?qū)?yīng)起來，有利于快速找到導(dǎo)致污染的原因，然后采取針對性措施加以防治，就可以減少逐個環(huán)節(jié)排查的大量工作。特別是在一些組織培養(yǎng)生產(chǎn)中，培養(yǎng)程序化，一旦發(fā)生重復(fù)性污染,往往是某個固定環(huán)節(jié)的失誤造成的，通過觀察污染的表觀現(xiàn)象，可以快速尋找到導(dǎo)致污染的原因，這樣可以大大節(jié)省人力和成本。污染幾率。在植物組織培養(yǎng)工作中，對培養(yǎng)基和器皿的徹底滅菌及正確的無菌操作是防止染菌、保證組培材料正常生長及分化的關(guān)鍵，是組培工作中最基本，也是最重要的技術(shù)。從事與組培工有關(guān)的科學(xué)工作者，在實踐中應(yīng)能根據(jù)工作的性質(zhì)、條件及要求，靈活、巧妙地應(yīng)用有關(guān)的原理，熟練、敏捷、正確地進行操作。滅菌、消毒和除菌所謂滅菌系指采用物理或化學(xué)的方法殺死物體表面及內(nèi)部的全部微生物。它有別于消毒。消毒一說來源于醫(yī)學(xué)，是一種衛(wèi)生措施，通常指只殺死有害的病原微生物。除菌是應(yīng)用機械或其他物理的方法除去液體或氣體中的微生物，達到無菌凈化之目的。可見滅菌及除菌后的物體或介質(zhì)是無菌的，而消毒后的物體可能仍含有許多微生物。在教學(xué)和工作中常常聽到把滅菌稱為消毒，將除菌說成滅菌，或?qū)缇?、消毒和除菌三個不同的概念混為一談。這是應(yīng)該予以澄清的。高溫滅菌高溫滅菌是指用熱能殺死微生物。其原理是高溫使原生質(zhì)中的蛋白質(zhì)變性、使酶失活致使微生物死亡。高溫滅菌是植物組培中最常用的滅菌方法，主要的有高溫蒸氣滅菌、干熱滅菌和灼燒滅菌。高溫蒸氣滅菌蒸氣滅菌屬濕熱滅菌。由于濕熱滅菌有潛熱存在，被滅菌物體的溫度比蒸氣的低，蒸氣在其表面凝結(jié)成水，放出潛熱，可迅速提高被滅菌物體的溫度。又由于水和水蒸氣比空氣的熱容量大、導(dǎo)熱快、穿透力強，所以，與干熱滅菌比，需要的溫度低、時間短，組培中常用于培養(yǎng)基和器皿的滅菌。水蒸氣的溫度隨其所受壓力的增加而升高，因而滅菌用的高溫蒸氣都是通過加壓獲得的。手提式高壓滅菌鍋是組培工作中最常用的高壓滅菌裝置。操作中常見的錯誤有排氣不徹底。在升壓前應(yīng)將鍋內(nèi)冷空氣排凈，因空氣是熱不良導(dǎo)體，若不排凈，冷空氣就會聚集并滯留在滅菌鍋中消毒筒的中下部，圍繞在待滅菌物周圍。在這種情況下，假若鍋內(nèi)空氣僅排除一半,當(dāng)壓力表指針達到時，鍋內(nèi)實際溫度僅能達到。C，比要求的低之多，將導(dǎo)致滅菌不徹底，可能造成大面積染菌。排氣軟管沒按要求插入滅菌筒內(nèi)的下部或排氣軟管斷裂、缺失。滅菌鍋內(nèi)的冷空氣是通過排氣軟管排出的，上述情況將造成滅菌筒外的蒸氣直接經(jīng)排氣閥排出鍋外，滅菌筒內(nèi)的空氣排放受阻。消毒筒內(nèi)物品堆積太緊、太滿阻礙蒸氣的流通和熱交換,使容器內(nèi)升溫減慢，造成物體內(nèi)部殺菌不完全。升溫過快。滅菌的時間是以達到要求溫度后的持續(xù)時間計算的，但溫度的升降過程同樣起到殺菌的作用，升降溫過快會通過影響總的積溫而影響滅菌效果。另外，升溫過快，特別是使用外源蒸氣的情況下，會造成被滅菌物體內(nèi)部升溫滯后于壓力表指示溫度。滅菌的物體休積容量過大。組培中，高溫蒸氣滅菌通常要在、即蒸氣壓力為，，或三?磅時，或下保溫。這一規(guī)定僅適用于試管、三角瓶中小容量的培養(yǎng)基小于。若體積過大，特別是固體培養(yǎng)基，會造成滅菌不徹底，應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時間。任意延長滅菌時間。規(guī)定的滅菌溫度和時間是經(jīng)過科學(xué)試驗制定的，只要按照正確的滅菌程序操作是能達到滅菌目的的。但在實踐中常有人為了“保證徹底滅菌”而任意延長滅菌時間。這樣操作忽視了殺菌過程中溫度對培養(yǎng)基成分的破壞作用是得不償失的。溫度不穩(wěn)定。滅菌過程中溫度壓力忽高忽低，特別是手提式電能滅菌鍋，它沒有控溫裝置，難于控溫。操作者可配置調(diào)壓變壓器，通過調(diào)節(jié)電壓控溫。此外，還常遇到滅菌鍋內(nèi)加水太少應(yīng)加一，容器內(nèi)裝的溶液量過多應(yīng)小于，安全閥失靈等問題。千熱滅菌指在烤箱內(nèi)用干熱空氣滅菌，常用于玻璃器皿和金屬用具的滅菌。由于空氣的導(dǎo)熱性和穿透力小于飽和蒸氣，加上菌體在受熱脫水情況下又較耐熱，因而，通常要在一'下連續(xù)滅菌才能達到滅菌目的。曾遇見的錯誤操作有將滅菌物品如培養(yǎng)皿堆揮放置，且堆得過滿、過擠，阻礙空氣流通和熱量的傳遞、交換升溫時不打開箱頂通風(fēng)孔，影響箱內(nèi)冷空氣及水氣噴出造成燒傷及突然降溫，使玻璃器皿破裂溫度過高大干造成包裝紙、棉塞焦化，失去防菌或過濾作用將不耐熱的槍頭、離心管、試管帽、濾器等塑料制品放入烤箱內(nèi)滅菌，而致其熔化。灼燒滅菌即直接利用火焰將微生物灼燒致死。其特點是簡便、迅速、徹底。主要用于接種工具及器皿的滅菌。如對接種環(huán)、鑷子、剪刀、玻棒、瓶口及封口用的鋁箔的滅菌。常見的錯誤操作有接種工具的滅菌范圍不夠，如對接種鑷子的滅菌，長度應(yīng)大于插入容器中的長度，且包括鑷子的內(nèi)外兩側(cè)接種工具沒有降至常溫即用于接種對玻璃器皿灼燒過度，使棉塞、封口膜焦化或熔化。過濾除菌除菌是指用過濾、離心分離、靜電吸附等機械或物理的方法除去氣、液體中的微生物。組培中常用的潔凈工作臺就是利用多孔濾板的吸附和過濾作用凈化空氣的。對液體培養(yǎng)基常用濾膜或玻璃濾器除菌，主要用于對熱不穩(wěn)定、易失活或分解的物質(zhì)，如酶液的除菌。最常遇到的問題是潔凈工作臺的環(huán)境不“潔凈”,不經(jīng)常拖擦地面，灰塵太多。有的甚至將工作臺放在走廊中，常落上一層塵土，這不但會極大地縮短潔凈工作臺的使用壽命，也會增加染菌的機率。有條件者最好放在一個密閉、潔凈的小室內(nèi)。對培養(yǎng)基過濾滅菌，應(yīng)精心選擇適當(dāng)孔徑的濾膜或濾板。乙醇滅菌乙醇?xì)⒕脑硎撬哂忻撍饔?。脫水作用?dǎo)致蛋白質(zhì)變性致使微生物死亡。乙醇的脫水作用在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度增加而加強。但是，其脫水作用能致使菌體表面形成一層蛋白質(zhì)膜，降低乙醇進入細(xì)胞的穿透力。乙醇既具有較強的殺菌力，又具有較強的穿透力，殺菌作用最強。這里應(yīng)著重指出的是，的乙醇濃度指的是重量百分比濃度，而很多人卻誤認(rèn)為是容量百分比濃度其容量百分比濃度約為。在實際應(yīng)用時還應(yīng)根據(jù)被滅菌物體表面的含水量靈活掌握，表面干燥的物體可用乙醇表面濕潤的植物材料可用乙醇?xì)⒕?，這樣可獲得更好的效果。若在乙醇中加入或殺菌效果會更好。蒸氣滅菌對培養(yǎng)墓的影響在高溫蒸氣滅菌過程中，培養(yǎng)基內(nèi)會發(fā)生一些化學(xué)反應(yīng)，培養(yǎng)基的成分會伴隨著發(fā)生一些變化。改變培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。淀粉、糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分在高溫下，特別是培養(yǎng)基值較高或較低時，會發(fā)生水解若有磷酸鹽存在，可使葡萄搪轉(zhuǎn)化成酮糖還原糖的撥基與氨基酸的氨基反應(yīng)形成氨基糖葡萄糖、乳糖和蔗糖糖液，在下保溫，可分別破壞達、和?？傊?，高溫滅菌對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分有明顯的破壞作用。培養(yǎng)基顏色變褐。其主要原因有還原糖與氨基酸在高溫下發(fā)生反應(yīng)，形成褐色物質(zhì)可溶性糖轉(zhuǎn)化成深色的焦糖。培養(yǎng)基的值降低。一般情況下，經(jīng)滅菌后培養(yǎng)基值下降，通?？上陆?。常遇到的問題是，培養(yǎng)基值調(diào)節(jié)得不準(zhǔn)確，若偏低，會出現(xiàn)滅菌后培養(yǎng)基不固化。在這種情況下絕不能調(diào)高值進行二次滅菌后再用。因為二次滅菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分會受到嚴(yán)重破壞。另一個問題是值下降會影響培養(yǎng)基成分的解離度、甚至帶電荷的性質(zhì)，影響培養(yǎng)物原生質(zhì)膜表面帶電荷的性質(zhì)及電荷量，進而影響原生質(zhì)體細(xì)胞對營養(yǎng)成分的吸收及其酶的活化和活力。產(chǎn)生沉淀物質(zhì)。滅菌后的培養(yǎng)基常出現(xiàn)渾濁和沉淀。主要原因是培養(yǎng)基中的、、、等陽離子在高溫下與磷酸鹽反應(yīng)形成沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)等有機大分子受熱變性、凝聚，產(chǎn)生沉淀。此外，滅菌還可產(chǎn)生對組培材料有抑制作用的有害物質(zhì)，產(chǎn)生凝水，改變培養(yǎng)基的體積和濃度接種時的無菌操作無菌操作技術(shù)直接地關(guān)系到組培材料的染菌率。實踐中曾遇到的問題有環(huán)境污染嚴(yán)重，對染菌與環(huán)境的相關(guān)性缺乏認(rèn)識對潔凈工作臺的滅菌只重視擦洗臺面，對操作臺的正面、頂部和左右壁不用乙醇噴霧滅菌紫外線殺菌時間太短應(yīng)為一，流于形式將大量待接種的培養(yǎng)瓶、器皿等放入潔凈工作臺內(nèi)，甚至放在工作面的前部，且不對它們進行殺菌處理，忘記了它們是帶菌者接種時不是將瓶口與送風(fēng)的流動方向平行，而是將瓶口向上或迎著來風(fēng)方向操作，不理解這樣操作會增加染菌率手的消毒流于形式，只用乙醇擦試，不用肥皂徹底清洗，消毒后任意抓摸帶菌的器皿、用具錯誤地認(rèn)為潔凈工作臺內(nèi)前半部的通風(fēng)量大，因而，接種時將兩臂連同腦袋伸到潔凈工作臺內(nèi)工作，不理解潔凈工作臺內(nèi)前后部的橫截面積相等，通風(fēng)量的大小是相同的?？傊?，無菌觀念不強，對染菌的原因缺乏深入的分析和認(rèn)識是產(chǎn)生上述錯誤操作的原因。以上分析說明，對組培有關(guān)原理的正確理解和規(guī)范的無菌操作不僅可降低染菌率、減少事故發(fā)生，更重要的是可保證組培材料健康的生長分化。因此，在教學(xué)中必須闡明組培的有關(guān)原理，對無菌操作嚴(yán)格要求，才能把學(xué)生培養(yǎng)成既懂原理又精于操作的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕M培工作者。污染是組織培養(yǎng)中普遍存在的問題。在植物快速繁殖過程中,培養(yǎng)基、接種器具、超凈工作臺、接種室消毒不嚴(yán)格或無菌操作不規(guī)范等均可導(dǎo)致污染的發(fā)生［9］。另外，對于植物本身,特別是對那些在熱帶、南亞熱帶生長的植物,由于常年高溫多雨,空氣濕度大,在植物莖葉表面容易滋生大量的微生物，甚至一些菌絲體侵入表皮內(nèi)的薄壁組織，不能被一般的表面消毒方法所清除，隨著材料帶入培養(yǎng)過程，引起內(nèi)生菌的污染［9?111］。這些都嚴(yán)重影響了組培苗的商業(yè)生產(chǎn)。因此，研究微生物污染的種類、來源、消毒方法及一些抑制劑的篩選，對減輕微生物造成的污染，提高培養(yǎng)的成功率和培養(yǎng)物的成活率，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益等都有重要意義。組織培養(yǎng)中,防止細(xì)菌特別是內(nèi)源菌污染很重要的措施就是在培養(yǎng)基中加入抑菌劑如抗生素等。但有些抗菌素效果不理想或不穩(wěn)定，陳維倫等(1991)［5］用卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、紅霉素和青霉素等多種抗菌素(100mg/L以下)處理,無滿意的結(jié)果。且較高濃度的抗菌素會傷害植物材料,引起對生長的抑制或畸變;先鋒霉素(氨噻肟頭胞霉素)2.5mg/L可以抑制細(xì)菌的生長。韓美麗等(1999)［6］在綠巨人組培中實驗了青霉素鈉、先鋒霉素和慶大霉素對繼代培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑菌效果，從成本上看，以青霉素鈉最低。但抗生素通常也只能抑制細(xì)菌生長而不能完全殺死它［1,6］?？股乜赡艹蔀橐环N選擇壓而引起微生物產(chǎn)生抗性突變體，潛伏的污染可能對植物以后的生長造成影響［1］。此外，抗生素一般不穩(wěn)定，遇酸、堿或加

熱都易分解而失去活性，把抗生素應(yīng)用于組培上，必然會增加工作量，增加成本,從而降低經(jīng)濟效益。所以有必要尋找穩(wěn)定、能耐高溫高壓的抑菌劑。本實驗初步表明,丙酸鈉、磷酸鈉均能耐高溫高壓,0.3%的丙酸鈉有較好的抑菌效果，在應(yīng)用于美鐵芋的快速繁殖上，發(fā)現(xiàn)0.5%的丙酸鈉對外植體的生長影響不大，所以，是一種較理想的抑菌劑，但其作用機理及其在植物組培中的應(yīng)用還有待更深入的研究。加入殼聚糖的PDA培養(yǎng)基，4d后能明顯觀察到菌落周圍有黑色暈圈，且黑色暈圈隨著菌落的生長而向外移。一般抑菌效果越好黑色暈圈越明顯。對照菌落始終沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。殼1及圖2所示)聚糖的分子量和濃度影響抑菌效果。(如圖圖15萬分子量殼聚糖不同濃度1及圖2所示)聚糖的分子量和濃度影響抑菌效果。(如圖圖15萬分子量殼聚糖不同濃度圖225萬分子量殼聚糖不同濃度抑菌效果的比較抑菌效果的比較抑菌效果的比較(A?F濃度依次為0.51.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml)參考文獻