第十章發(fā)酵工程案例(講1)

第九章發(fā)酵工程生產案例高永生1概述抗生素的生產工藝生產前期研究生產菌改良生產工藝過程發(fā)酵條件的控制提取和精制第一節(jié)抗生素發(fā)酵生產技術2一、概述1、什么是抗生素(antibiotics)

？由生物（微生物、植物和動物）產生的次級代謝產物，能夠在一定濃度下有選擇地抑制或殺死其他微生物或腫瘤細胞3微生物發(fā)酵法(主要），如青霉素等化學合成法（極少數(shù)），如氯霉素、磷霉素等半合成法，如氨芐青霉素、頭孢利定等抗生素來源4

2、

分類

根據(jù)抗生素的作用范圍廣譜抗生素：氨芐青霉素等抗革蘭氏陽性菌：青霉素等抗革蘭氏陰性菌：鏈霉素等抗真菌：制霉菌素等抗病毒：四環(huán)類抗生素等抗腫瘤：阿霉素等5根據(jù)抗生素的作用機制抑制細胞壁合成：青霉素類、頭孢霉素類等影響細胞膜功能：多烯類抗生素等抑制病原菌蛋白質合成：四環(huán)素等抑制核酸合成：絲裂霉素C等抑制生物能作用：抗霉素等67β-內酰胺類：青霉素類、頭孢菌素類氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素等大環(huán)內酯類：紅霉素、麥迪霉素等四環(huán)類抗生素：四環(huán)素、土霉素等多肽類抗生素：多粘菌素、桿菌肽等根據(jù)抗生素的化學結構8根據(jù)抗生素的生物來源放線菌產生的抗生素：鏈霉素、四環(huán)素等

真菌產生的抗生素：青霉素、頭孢霉素D等細菌產生的抗生素：多黏菌素植物或動物產生的：蒜素、魚素等9根據(jù)抗生素的合成途徑

氨基酸、肽類衍生物抗生素：青霉素、頭孢霉素類等四環(huán)素等糖類衍生物抗生素：鏈霉素糖苷類乙酸、丙酸衍生物抗生素：紅霉素等丙酸衍生物101928年，F(xiàn)leming發(fā)現(xiàn)可抑制葡萄球菌生長的青霉素；1943年（二戰(zhàn)期間），病理學家Florey和化學家Chain共同努力下實現(xiàn)了大規(guī)模發(fā)酵生產（從實驗室到工業(yè)）；青霉素的應用使美國軍隊中肺炎患者死亡率由一戰(zhàn)期間的18％下降到二戰(zhàn)期間的1％；1945年，F(xiàn)leming、Florey,andChain被授予諾貝爾生理學和醫(yī)學獎；青霉素的研制成功，激發(fā)了抗生素的探索和研究工作如火如荼的發(fā)展，史稱“抗生素革命”。20世紀中抗生素使人類平均壽命延長了15年以上。3、青霉素歷史11青霉素的故事已經世界聞名，它提供了一個不同的科學方法，為一個共同的偉大目標而合作的光輝榜樣。

——諾貝爾獎頒獎致詞124、現(xiàn)狀藥物分類年增長率%排名心血管81中樞神經系統(tǒng)122營養(yǎng)/代謝63呼吸系統(tǒng)84抗感染45世界前5名藥品銷售情況（IMSHealth提供)13國內現(xiàn)狀抗感染藥以26.5%的市場份額高居醫(yī)院用藥大類中的榜首，第二名為心血管系統(tǒng)藥物占15.5％。從單個品種來看，排名前20位的品種中有11個都是抗感染藥（中國醫(yī)院用藥數(shù)據(jù)）。復旦大學附屬兒科醫(yī)院的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，該院每年銷售收入排序前3位的藥物均為抗生素。凡超時、超量、不對癥使用或未嚴格規(guī)范使用抗生素，都屬于抗生素濫用。14開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右，而一代耐藥菌的產生只要2年，抗生素的研制速度遠遠趕不上耐藥菌的繁殖速度抗生素“黃金時代”的五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約700萬，1999年上升到2000萬。主要原因是耐藥菌帶來的用藥困難。以對甲氧西林耐藥的葡萄球菌為例，80年代初，95%有效，1985年，有效率下降了20%，1992年，美國首次發(fā)現(xiàn)了對萬古霉素產生耐藥性的葡萄球菌，醫(yī)生幾乎無藥可用。有遠見的醫(yī)學界人士擔心，隨著病菌耐藥性“進化”速度的加快，人類將又回到抗生素誕生前的黑暗歲月?？股啬退幮?5我越來越心虛，因為我們武器庫里的武器已經越來越少----張永信教授

16美麗的悲哀17醫(yī)學的最高境界治未病思考18發(fā)酵工程三大要素生產菌種的性能發(fā)酵及提純工藝條件生產設備發(fā)酵工程二、抗生素的生產工藝19菌種的制備種子擴大培養(yǎng)發(fā)酵工藝控制發(fā)酵液預處理代謝產物分離純化干燥產品發(fā)酵法生產抗生素的一般流程1、20

2．生產前期研究生產菌種的篩選生產菌種的改良發(fā)酵過程的優(yōu)化和比擬放大（Scale-up）21開發(fā)設計采集樣品富集培養(yǎng)純種培養(yǎng)原種斜面篩選（初篩、復篩）通過篩選的菌種/斜面性能鑒定育種出發(fā)菌菌種保藏菌種保藏機構提供的純種斜面市場調研文獻分析生產菌種分離和篩選1）生產菌種的篩選22a)抗生素類藥物一般檢查項目：①鑒別試驗:用化學法、物理化學法以及生物學法來確認是哪種抗生素;②毒性試驗:控制藥品中的毒性物質;③無菌試驗:檢查藥品中有無雜菌污染;④熱源試驗:控制藥品中的致熱物質;⑤水分測定:控制水分含量;⑥溶液澄明度檢查:檢查不溶性物質;⑦

溶液pH試驗:測定pH;⑧降壓試驗:檢查有降壓作用的雜質;⑨

效價測定:有效成分測定.23b)效價測定抗生素的效價測定方法:生物學法物理化學法目前各國藥典仍以生物學測定法為主。24生物學測定法優(yōu)點：缺點:抗生素抑制細菌生長能力或殺菌能力作為衡量效價標準①原理恰好與臨床要求一致，更能夠確定抗生素效價。②靈敏度高，需要樣品量較小;③既適用較純精制品,也適用于純度較差的產品;④已知或新發(fā)現(xiàn)抗生素都能應用;⑤同一類型抗生素,不需分離可一次測定它們的總效價。①

操作步驟多，測定時間較長；②

誤差較大；③不能判斷抗生素的化學物質和結構25

Agardiffusionassay瓊脂培養(yǎng)基測試菌苔含藥物濾紙抑菌圈26ii)物理化學測定法抗生素的分離純化利用抗生素化學結構特有的物化性質(波譜特征）及反應進行核磁共振（碳譜、氫譜及其雜合譜）毛細管電泳氣相色譜高效液相色譜質譜紅外光譜、紫外光譜27現(xiàn)代分析儀器操作簡單、省時、方法準確;具有較高的專屬性缺點:對于結構相似的抗生素，測定結果往往只能代表總的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效價;只有物理化學法測定結果與用生物學法測定效價相一致時，才能用于效價測定。優(yōu)點282）抗生素生產菌改良生產菌種改良自然選育人工誘變雜交育種基因工程原生質體融合29人工誘變法實用而傳統(tǒng)的誘變――篩選育種技術尚在普遍使用物理誘變：紫外線、X-線、r-線、快中子、激光化學誘變：1）堿基類似物：2－氨基嘌呤、5－溴基嘧啶等；2）與堿基反應的物質：如亞硝基胍、亞硝酸、秋水仙素等；3）DNA分子中插入或缺失一個或幾個堿基：丫啶類物質，丫啶氮芥衍生物等生物誘變：噬菌體、轉座子30基因工程（DNA重組技術）

克隆核酸內切酶基因工程為核心的高新技術終將成為育種的主導技術31菌種擴大培養(yǎng)原種搖瓶培養(yǎng)（一級）二級搖瓶培養(yǎng)各種培養(yǎng)基小型發(fā)酵罐模擬生產條件中試生產工業(yè)化生產3）發(fā)酵過程的Scale-up（比擬放大）斜面活化32Scale-up（比擬放大）modelsELGaddenJr<10

dm3優(yōu)質高產>200m3同樣生產率?控制參數(shù)?模擬33搖瓶發(fā)酵Shake-flask裝液量：~250mL間歇培養(yǎng)溫控受限制代謝碳水化合物慢常壓緩沖液控制pH在線取樣難容量減少瓶壁上結垢無需消泡攪拌受限制無法控制DO10-105L間歇和補料培養(yǎng)連續(xù)控制：pH，溫度需要銨鹽或氨氣2大氣壓無需緩沖液在線取樣易補料，容量增加生長均勻一致需消泡多種攪拌控制DO:通氣，加壓攪拌罐發(fā)酵Stirredtank34菌種

→種子制備

→發(fā)酵工藝控制

→發(fā)酵液預處理→提取及精制→成品包裝3.抗生素生產工藝過程35Aschemeofthematerialflowinanantibioticproduction連消發(fā)酵罐緩沖罐361）發(fā)酵生產原料碳源:甜菜和甘蔗糖蜜葡萄糖，乳糖，淀粉乙醇，甲醇甘油麥芽糖漿，玉米糖漿綿籽油，花生油，豆油豬油油酸甲酯油脂氮源:綿籽粉玉米粉和玉米浸出液大豆粉和大豆面花生粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液乳清魚粉酵母酵母膏肉粉和骨粉

前體無機鹽37

培養(yǎng)基組成

比例%葡萄糖/蔗糖3.0-5.0淀粉3.0-5.0玉米浸提液3.0-5.0碳酸鈣0.5-1.0磷酸鹽0.1-0.5硫酸胺0.1-1.0尿素0.1-0.5油0.1-0.5Fermentation發(fā)酵培養(yǎng)基

組成比例%葡萄糖/蔗糖0.5-1.0淀粉0.5-5.0玉米浸提液5.0-8.0豆粉1.0-5.0磷酸鹽0.5-1.0

定期添加油1.0玉米糖漿連續(xù)加料Tankseed種子培養(yǎng)基38小型發(fā)酵罐2）發(fā)酵控制39

樣品分析pHDO糖氨類化合物磷酸鹽硫酸鹽Products前體物（PAA）污染探針：壓力液位pHTempDO消泡劑酸堿水冷卻通氣/攪拌流加碳氮工藝條件控制40Scale重量計控制添加量泵壓控制流量放大器控制器SupervisoryComputer

物料流量控制發(fā)酵過程的參數(shù)檢測和自動控制41監(jiān)控中心42

HNONSCH3CH3HCOO-H

β-內酰胺環(huán)RR=苯乙酰CH2-CO-三、青霉素的生長工藝天然青霉素化學結構43β-內酰胺環(huán)多種N-?；〈嗝顾?41）產黃青霉的生長階段分生孢子（1期）；菌絲繁殖、原生