燈盞花素對糖尿病大鼠腎組織巨噬細胞浸潤的影響

燈盞花素對糖尿病大鼠腎組織巨噬細胞浸潤的影響

近年來的研究表明，誘導腎組織炎的腎組織炎過程是糖尿病腎炎（dn）第一次損傷可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。晚近有學者發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑霉酚酸酯(Mycophenolatemofetil,MMF)對DN的保護作用機制主要是抑制腎組織巨噬細胞浸潤。燈盞花素(Breviscapine)是從菊科飛蓬屬植物短亭飛蓬全草燈盞細辛中提取出的一類黃酮類成分,其藥理作用有較強抗氧化、抑制蛋白激酶C(ProteinkinaseC,PKC)活性作用。最近,我們與其他學者在大鼠DN模型中已初步證實其能降低蛋白尿、改善腎小球結(jié)構(gòu)異常。由于糖尿病狀態(tài)下氧化應激增加產(chǎn)生的氧反應產(chǎn)物(Reactiveoxygenspecies,ROS)及PKC激活均可誘導多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生刺激腎組織巨噬細胞浸潤,燈盞花素是否能抑制糖尿病腎組織巨噬細胞浸潤尚未見文獻報道,本研究從DN炎癥發(fā)病角度進一步探討其腎臟保護機制。1材料和方法1.1單抗ss-nd-pcrmsf燈盞花素:云南玉溪藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,臨用前用5g·L-1羧甲基纖維素鈉配制所需濃度的混懸液;MMF:瑞士羅氏制藥有限公司產(chǎn)品,臨用前溶解在5%二甲基亞砜中,并用花生油稀釋至所需濃度;鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):Sigma公司,臨用前溶解在0.01mol枸櫞酸緩沖液中,pH4.5;尿白蛋白測定試劑盒:法國SPI公司產(chǎn)品;PKC活性測定試劑盒:Calbiochem公司;兔抗大鼠單核細胞趨化蛋白-1(Monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)、細胞間黏附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)多克隆抗體及小鼠抗大鼠ED-1(巨噬細胞表面標志)單克隆抗體:SantaCruza公司產(chǎn)品;生物素標記的羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG:武漢博士德公司產(chǎn)品;鏈酶親和素-生物素復合物(SABC):武漢博士德公司;內(nèi)源性生物素封閉劑:福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;DAB試劑盒:北京中山技術(shù)有限公司。1.2分組及給藥方法40只昆明種SD大鼠,♂,體重180～200g,安徽醫(yī)科大學動物中心提供。所有大鼠均行右側(cè)腎切除術(shù),2wk后按體重分層隨機分對照組、模型組、燈盞花素給藥組及MMF給藥組,每組10只。糖尿病模型建立采用腹腔一次性注射STZ60mg·kg-1方法,燈盞花素20mg·kg-1·d-1,灌胃給藥,MMF10mg·kg-1·d-1,灌胃給藥,對照組、模型組給予等量溶媒。燈盞花素與MMF均為通過預試驗所選合適劑量。所有大鼠在整個實驗期間均喂標準飲食,自由飲水,不應用胰島素,整個實驗觀察8wk。1.3腎組織病理學檢測大鼠處死前2d進代謝籠,準確收集24h尿液,離心分裝后保存于-70℃冰箱中待測尿白蛋白含量。然后在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右側(cè)頸總動脈插管收集血標本,4℃離心取血漿保存于-20℃待測血糖水平。腎臟通過右側(cè)頸總動脈插管注入4℃預冷的生理鹽水反復灌洗,至整個腎臟顏色變蒼白后游離,置于冰上,取8mm3大小腎組織置于10%中性甲醛溶液中固定,乙醇梯度脫水,石蠟包埋,制成厚度為3μm切片,行PAS染色。同時制4μm多聚賴氨酸處理切片,免疫組化研究。剩余腎組織分別切成小塊,置于液氮中,凍透后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中待測腎組織PKC活性。1.4雙管測定尿白蛋白測定采用EIA,嚴格按照試劑盒說明書操作。標準液濃度1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81μg·L-1,設雙管測定。24h尿白蛋白排泄率(Albuminexcretionrate,AER))為尿白蛋白含量與24h尿量乘積。1.5放射性活性測定腎組織細胞膜和細胞漿分離采用超速離心法,蛋白定量采用考馬斯亮藍法,PKC活性采用放射活性測定法,嚴格按照試劑盒說明書操作。酶的活性單位表示為nmol·g-1·min-1,胞漿PKC(PKCc)及胞膜PKC(PKCm)活性均以所測的實際活性與對照組所得的活性之差表示,細胞PKC總活性(PKCt)為胞漿及胞膜PKC活性之和。1.6小鼠ed-1免疫法檢測小鼠血清蛋白及表達采用SABC法:切片常規(guī)脫蠟水化,3%H2O2甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶;用微波暴露抗原,封閉內(nèi)源性生物素和親和素;滴加1∶10正常羊血清或兔血清;10%小牛血清蛋白室溫下孵育2h,封閉非特異性抗原。分別滴加兔抗大鼠MCP-1與ICAM-1多克隆抗體(均為1∶200)及小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體(1∶50),4℃過夜。滴加生物素化二抗IgG(1∶200),37℃40min;滴加SABC,37℃20min。洗滌后室溫下滴加DAB顯色液,鏡下控制顯色時間。中止反應后,蘇木素復染3min,1%鹽酸乙醇分化。常規(guī)脫水、透明、封片。實驗均采用刪除第一抗體作陰性對照。陽性物質(zhì)呈棕色顆粒狀,在高倍鏡視野下隨機選擇50個腎小球,計數(shù)每個腎小球橫截面積(glomerularcrosssection,gcs)ED1陽性細胞數(shù),取均值;MCP-1、ICAM-1免疫組化陽性結(jié)果判斷應用圖像分析系統(tǒng),計算其陽性指數(shù)(Positiveindex,PI),PI=[陽性信號面積×平均陽性強度(平均灰度值)/腎小球面積。1.7統(tǒng)計分析方法實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,應用SPSS11.0軟件包進行統(tǒng)計分析,參數(shù)資料采用One-WayANOVA檢驗,非參數(shù)用秩和檢驗。2結(jié)果2.1mf對mf的影響模型組血糖明顯高于、體重明顯低于對照組(P<0.01),燈盞花素或MMF給藥組血糖、體重與模型組相比無差異;模型組腎重、腎重/體重及AER明顯高于對照組(P<0.05,P<0.01),燈盞花素或MMF給藥組腎重、腎重/體重及AER明顯低于模型組(P<0.05,Tab1)。2.2腎組織相關(guān)活性模型組腎組織PKCt活性、PKCc活性、PKCm活性及PKCm/PKCc明顯高于對照組(P<0.05,P<0.01);燈盞花素給藥組腎組織PKCt活性、PKCc活性、PKCm活性及PKCm/PKCc明顯低于模型組(P<0.05);MMF給藥組腎組織PKC活性與模型組相比無差異(Tab2)。2.3小鼠臟器+模型的小鼠骨髓水浸單次給藥的效果對照組腎小球有少許巨噬細胞浸潤,模型組腎小球巨噬細胞浸潤明顯高于對照組(P<0.01),燈盞花素或MMF給藥組腎小球巨噬細胞浸潤明顯低于模型組(P<0.05);對照組腎小球MCP-1、ICAM-1表達較弱,模型組表達明顯高于對照組(P<0.01),燈盞花素或MMF給藥組腎小球MCP-1、ICAM-1表達明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01),但燈盞花素給藥組腎小球ICAM-1表達高于MMF給藥組(P<0.05,Tab3,Fig1)。3對糖尿病腎組織細胞黏附因子的影響實驗研究表明糖尿病模型建立后24h腎小球內(nèi)即出現(xiàn)大量巨噬細胞浸潤,隨著時間延長逐漸增多,并與IV型膠原表達、腎小球結(jié)構(gòu)改變相一致,在臨床DN患者腎組織標本中也發(fā)現(xiàn)類似情況。浸潤的巨噬細胞通過釋放前炎癥介質(zhì)、前硬化介質(zhì)及ROS導致腎組織損害。目前DN的治療仍以控制高血糖、阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensinsystem,RAS)為主,但大部分患者仍然緩慢進展至終末期腎衰。晚近Sassy-Prigent等報道在糖尿病早期應用胰島素嚴格控制血糖可完全抑制腎內(nèi)巨噬細胞浸潤及MCP-1mRNA表達,阻斷RAS則可部分抑制腎內(nèi)巨噬細胞浸潤及MCP-1mRNA表達,對腎組織ICAM-1、血管細胞黏附因子及腫瘤壞死因子α、白介素-1β表達無明顯影響。如在改善糖尿病糖代謝與血管動力學紊亂基礎上,選擇特異性抑制腎組織炎癥過程的藥物可能會進一步改善DN預后。MMF可非競爭性、可逆性地抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶,阻斷鳥嘌呤核苷酸的從頭合成途徑,使鳥嘌呤核苷酸耗竭,進而阻斷DNA和RNA的合成,其主要藥理作用抑制淋巴細胞與單核細胞增殖,減少抗體產(chǎn)生,抑制細胞表面粘附分子的合成,對系膜細胞及平滑肌細胞有抑制作用。晚近,Utimura等與我們在STZ誘導的單側(cè)腎切除糖尿病模型中發(fā)現(xiàn)MMF可明顯減輕蛋白尿、抑制腎小球肥大及硬化,其機制主要為抑制腎小球內(nèi)巨噬細胞浸潤,對糖尿病腎小球血流動力學紊亂無明顯影響。由于MMF應用于DN臨床安全性尚待進一步證實,該實驗以MMF為陽性對照,選擇具有明顯腎臟保護作用的中草藥燈盞花素,觀察其對糖尿病腎組織巨噬細胞浸潤的影響,研究結(jié)果顯示燈盞花素同MMF一樣可抑制糖尿病腎組織巨噬細胞浸潤,進一步從抗炎角度證實其腎臟保護作用。糖尿病腎組織巨噬細胞浸潤與激活主要由MCP-1與ICAM-1介導,其中MCP-1是巨噬細胞特異性趨化因子,對巨噬細胞有較強的趨化與激活作用,ICAM-1主要介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)之間的黏附作用。最近,我們研究表明MMF對糖尿病腎組織巨噬細胞浸潤的抑制主要是通過下調(diào)MCP-1與ICAM-1表達實現(xiàn)。糖尿病狀態(tài)下腎組織MCP-1與ICAM-1表達增加既有代謝紊亂因素,又有血流動力學因素,代謝紊亂與血流動力學因素也是腎內(nèi)氧化應激增加與PKC激活的起始因素,ROS可直接誘導MCP-1與ICAM-1表達,在體外高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞已證實ICAM-1表