cyp35基因多態(tài)性在腎移植術(shù)后他克莫司個體化用藥中的臨床應用

cyp35基因多態(tài)性在腎移植術(shù)后他克莫司個體化用藥中的臨床應用

tacmosi（tac，fk506）的治療窗口狹窄，藥物代謝個體差異很大。如何合理使用fk506成為移植醫(yī)生臨床工作的難點。FK506在腎移植受體中藥代動力學參數(shù)個體差異的最主要原因是CYP3A5*3多態(tài)性。CYP3A5*3多態(tài)性是唯一對腎移植受體FK506起始用量具有明確指導意義的基因多態(tài)性。但是,目前關(guān)于CYP3A5*3基因型與腎移植術(shù)后藥代動力學及藥效學參數(shù)關(guān)系的研究大多數(shù)為橫斷面和回顧性研究,國內(nèi)外尚缺乏關(guān)于根據(jù)CYP3A5*3多態(tài)性調(diào)整移植術(shù)后FK506初始用量的隨機性、前瞻性臨床研究資料。本研究通過腎移植術(shù)前測定CYP3A5*3基因型,進行隨機的前瞻性研究,研究CYP3A5*3基因多態(tài)性指導腎移植術(shù)后FK506個體化用藥的臨床應用價值及可行性,為不同CYP3A5*3基因型腎移植受體的FK506初始劑量提供參考。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例選擇及基因型選擇2008年11月至2009年12月在我院進行的親屬活體腎移植術(shù)的患者為研究對象,所有患者均為首次腎移植術(shù),術(shù)前基礎(chǔ)疾病為慢性腎小球疾病,無糖尿病、肝炎、急性感染等合并癥。研究符合中南大學湘雅三醫(yī)院人體實驗委員會所制定的倫理學標準,取得倫理委員會的批準同意,并與患者或其家屬簽署知情同意書。根據(jù)入選及排除標準,共入選病例83例。實驗組40例,其中男28例,女12例,平均年齡(36.8±9.5)歲,平均體重(58.01±11.48)kg,*1/*1型4例,*1/*3型12例,*3/*3型24例。對照組43例,其中男33例,女10例,平均年齡(35.1±9.5)歲,平均體重(59.33±9.71)kg,*1/*1型5例,*1/*3型13例,*3/*3型25例。通過χ2檢驗分析,兩組不同基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡。兩組受體的性別、年齡及體重比較無顯著差異。1.2pcr擴增聚合酶鏈反應分子身份證bp術(shù)前1~2周抽取腎移植受體靜脈血3mL,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。按照DNA抽提試劑盒(Promega,美國試劑盒)說明書提取外周血基因組DNA,于4~8℃保存?zhèn)溆?。采用聚合酶鏈反?polymerasechainreactions,PCR)的方法擴增目的基因片段。上游引物:5′-Biotin-AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3′,5′端由生物素標記,下游引物:5′-CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3′,測序引物:5-CCAAACAGGGAAGAGATA-3′,由上海博尚生物科技有限公司合成。PCR體系50μL:10×PCR反應緩沖液5μL,三磷酸脫氧核糖核酸(dNTP)4μL(各10mmol/L),蒸餾水37.5μL,正引物和負引物各0.5μL(100μmol/L),rTaqDNA多聚酶0.5μL(5U/μL)(Qiagen,德國試劑盒),染色體DNA2.0μL(20~30μg/mL)。PCR條件為94℃預變性10min,變性、退火、延伸分別為94℃30s,55℃30s,72℃45s,共50個循環(huán),最后72℃延伸7min。20g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測聚合酶鏈反應擴增產(chǎn)物,可見239bp條帶。根據(jù)PyromarkID操作說明對PCR產(chǎn)物進行單鏈提取純化,并于PyromarkID儀器對SNP進行分析,通過PyrogramTM結(jié)果圖判讀結(jié)果。1.3cyp3a1不同初始劑量對大鼠血清中耐藥藥物的影響隨機將患者分為實驗組和對照組,實驗組和對照組腎移植術(shù)后均采用FK506+霉酚酸酯+潑尼松免疫抑制方案。實驗組根據(jù)CYP3A5基因型的不同調(diào)整腎移植術(shù)后FK506的初始劑量,表達型(CYP3A5*1/*1和CYP3A5*1/*3型)為0.15mg/(kg·d),不表達型(CYP3A5*3/*3)為0.075mg/(kg·d),對照組按照傳統(tǒng)的給藥劑量,表達型和不表達型起始劑量均采用0.10mg/(kg·d)。實驗組與對照組霉酚酸酯和潑尼松的使用方案無差別。術(shù)后第7天開始監(jiān)測FK506全血藥物濃度,以后根據(jù)目標濃度來調(diào)整FK506劑量,術(shù)后3個月內(nèi)血藥谷值濃度控制在6~10ng/mL,以后控制在5~8ng/mL。1.4全血fk506藥物濃度檢測患者于前1天20:00服用FK506,次晨8:00服藥前抽血1mL,15%EDTA抗凝,采用均相酶擴大免疫分析法(enzymemultipliedimmunoassaytechnique,EMIT)測定全血FK506藥物濃度(Emit2000他克莫司試劑盒,購自SIEMENS公司)。所有患者均未服用抗結(jié)核藥、抗病毒藥物等已知可以明顯影響CYP3A5活性的藥物及食物。1.5fk506對不良反應的影響收集術(shù)后早期患者住院期間(2周)的藥物劑量、血藥濃度、調(diào)整劑量的次數(shù),術(shù)后定期隨訪至少3個月,并記錄3個月內(nèi)FK506劑量、濃度、體重以及肝腎功能、血糖、血脂等生化指標,記錄有無發(fā)生急性排斥反應,有無失眠、手顫等不良反應的發(fā)生。比較實驗組和對照組兩組腎移植術(shù)后7d內(nèi)達到目標血藥濃度范圍(6~10ng/mL)的百分比、需調(diào)整藥物劑量的百分比以及3個月內(nèi)急性排斥反應和藥物不良反應(神經(jīng)毒性、高血糖等)發(fā)生率之間的差異。1.6軟件基因分布應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,用非參數(shù)統(tǒng)計方法進行非正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)的比較,用χ2檢驗分析兩組受體等位基因分布,是否符合Hardy-Weinberg平衡;兩組間達到有效血藥濃度百分比、需調(diào)整藥物劑量的百分比以及3個月內(nèi)發(fā)生急性排斥反應和藥物不良反應發(fā)生率采用χ2檢驗,兩組間其余數(shù)值變量采用t檢驗。2結(jié)果2.1腎移植術(shù)后fk506濃度實驗組腎移植術(shù)后第7天平均血藥濃度為(7.65±2.14)ng/mL,濃度范圍4.3~13.2ng/mL。對照組腎移植術(shù)后第7天平均血藥濃度為(8.53±4.79)ng/mL,濃度范圍2.1~25.4ng/mL。兩組受體不同基因型患者腎移植術(shù)后第7天FK506濃度范圍及需要調(diào)整劑量的患者比例詳見表1。實驗組達到FK506目標藥物濃度范圍的占62.5%(25/40),對照組僅32.6%(14/43),實驗組需要調(diào)整FK506劑量的占35.0%(14/40),對照組占65.1%(28/43)。兩組移植術(shù)后第7天達到目標濃度范圍的患者百分比及需要調(diào)整劑量的患者百分比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。2.2兩組fk506不良反應發(fā)生率的比較腎移植術(shù)后3個月內(nèi)兩組急性排斥反應的發(fā)生率分別為20.0%和25.6%,兩組FK506不良反應的發(fā)生率分別為12.5%和18.6%,實驗組均低于對照組,但兩組比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。3cyp3a1不表達型受體腎移植術(shù)后總體展望目前治療藥物濃度監(jiān)測(therapeuticdrugmonitoring,TDM)和根據(jù)濃度調(diào)整劑量是臨床上指導FK506個體化治療的基本手段。在我國,腎移植術(shù)后免疫抑制劑的臨床應用一般采用經(jīng)驗性給藥,即FK506的初始劑量通常按0.10mg/(kg·d)給藥,然后根據(jù)TDM結(jié)果調(diào)整劑量。但是TDM只有在使用了藥物以后才能實施,并不能用于指導患者理想的初始用量。遺傳藥理學研究發(fā)現(xiàn),CYP3A5*3多態(tài)性是影響FK506個體化差異最重要的因素。只有野生型等位基因CYP3A5*1攜帶者才會顯著表達CYP3A5。CYP3A5*3使基因剪接位點隱藏,使含有131個核苷酸的基因序列插入到mRNA中,引起終末密碼子過早剪切CYP3A5蛋白,從而使其失去酶的活性。攜帶CYP3A5*1等位基因的患者,FK506的清除率要高25%~40%,FK506劑量校正谷濃度(C0)要較低,需要增加口服劑量才能達到與*3/*3型相似的靶濃度范圍[1,8,9,10,11,12,13]。與TDM不同,CYP3A5*3基因型不會因為時間而改變,可以在移植術(shù)前進行測定,對不同個體FK506的代謝類型進行預測,可以從遺傳藥理學的科學角度為腎移植受體提供一條真正實現(xiàn)個體化藥物治療的途徑。根據(jù)我們前期回顧性分析的結(jié)果,我們采用Haufroid等推薦的給藥劑量方案,即CYP3A5不表達型(CYP3A5*3/*3基因型)的受體起始劑量為0.075mg/(kg·d),而CYP3A5表達型(CYP3A5*1/*1或CYP3A5*1/*3基因型)的受體采用雙倍起始劑量即0.150mg/(kg·d)。我們研究發(fā)現(xiàn)實驗組腎移植術(shù)后第7天達到目標濃度范圍的比例為62.5%,明顯高于對照組的32.6%(P=0.006)。按0.10mg/(kg·d)常規(guī)給藥的對照組中,CYP3A5表達型受體與不表達型受體達到目標濃度范圍的百分率相近,分別為27.8%和36.0%。CYP3A5表達型有66.7%的受體血藥濃度低于目標濃度,比例顯著高于CYP3A5不表達型受體;而CYP3A5不表達型則有52.0%受體血藥濃度高于目標濃度,比例顯著高于CYP3A5表達型。因此,按傳統(tǒng)的給藥劑量給藥,會造成相當大一部分CYP3A5表達型受體腎移植術(shù)后早期難以達到目標濃度范圍,而很大一部分CYP3A5不表達型受體則FK506濃度過高。在實驗組中根據(jù)CYP3A5*3調(diào)整FK506劑量后,CYP3A5不表達型受體高于目標濃度的患者比例明顯減少(對照組CYP3A5不表達型受體高于10ng/mL的占52.0%,而實驗組僅20.8%),使CYP3A5不表達型受體達到目標濃度范圍的比例升高至58.4%(14/24)。對于CYP3A5表達型受體,加大給藥劑量后,CYP3A5表達型受體達到目標濃度范圍的比例由對照組的27.8%(5/18)升高到68.8%(11/16),而高于目標血藥濃度的比例并沒有升高(實驗組為0%,對照組為5.5%,P=0.274)。研究結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)給藥劑量給藥的對照組相比,調(diào)整初始劑量以后,使CYP3A5不表達型受體高于目標濃度范圍的比例顯著降低,而達到目標濃度范圍的比例顯著升高,但并不會使低于目標濃度范圍的患者比例升高;而對于CYP3A5表達型,調(diào)整初始劑量以后,使得CYP3A5表達型受體低于目標濃度范圍的比例顯著降低,而達到目標濃度范圍的比例顯著升高,但高于目標濃度范圍的比例并未升高。因此,根據(jù)基因型的不同調(diào)整FK506初始劑量,可以使更多的患者在移植術(shù)后早期快速達到目標血藥濃度范圍,減少了FK506暴露不足或者暴露過量的患者的比例,使第7天時需要調(diào)整劑量的患者比例明顯減少(35.0%vs65.1%)。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然實驗組急性排斥反應及藥物不良反應發(fā)生率均要比對照組稍低,但兩組比較并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。這主要是因為我們目前所積累的病例有限,此外,大部分急性排斥反應屬于臨床診斷,未經(jīng)過穿刺活檢這個金標準加以證實。因此根據(jù)CYP3A5*3調(diào)整腎移植受體FK506初始用量對FK506近遠期療效的影響還有待進一步深入研究?？傊?我們研究認為,腎移植受體移植術(shù)后FK506起始劑量按CYP3A5*3/*3基因型個體采用0.075mg/(kg·d),而CYP3A5*1/*1或CYP3A5*1/*3基因型個體采用0.150mg/(k