第四章 動物組織細(xì)胞培養(yǎng)

第四章動物細(xì)胞培養(yǎng)1目錄4.1動物細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境4.2動物細(xì)胞體外培養(yǎng)方法4.3動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性4.4培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定4.5細(xì)胞同步化4.6細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇4.7器官培養(yǎng)2防止污染、無菌操作是動物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵！31）培養(yǎng)前準(zhǔn)備：制定實驗計劃和操作程序。2）超凈臺要用75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30分鐘，工作臺面上用品不要過多或重疊放置。3）個人進(jìn)入無菌培養(yǎng)室原則上須徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝，開始操作前要用75%酒精或0.2%新潔而滅消毒手和前臂。4）實驗中需保持無菌操作要求。實驗前要點(diǎn)燃酒精燈，燒過的器械要注意冷卻，以防細(xì)胞損傷。5）分別使用不同吸管吸取營養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液，而不能混用6）不要用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰灼燒或取備用品更換。7）注意操作時勿大聲講話或咳嗽。4基本概念分類：器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)定義：

動物細(xì)胞培養(yǎng)是指將動物的某一組織如肝臟、肺、腎臟等組織取出，使其分散成單個細(xì)胞，在人工條件下(無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下)，使之存活、生長和增殖的技術(shù)。5基本概念定義：

動物組織培養(yǎng)(tissueculture)是指從動物體內(nèi)取出組織并模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之在體外人工條件下生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能不變的技術(shù)。器官培養(yǎng)(organculture)的培養(yǎng)對象是整個器官、器官的一部分，是在模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之在體外存活、生長和保持一定功能的技術(shù)。6基本概念74.1動物細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境4.1.1溫度4.1.2pH4.1.3滲透壓4.1.4氣相4.1.5生長基質(zhì)84.1.1溫度

無論來源于何種有機(jī)體的細(xì)胞培養(yǎng)都需要一個與體內(nèi)生存環(huán)境盡可能一致的生長條件，其中最基本的條件之一是恒定的適宜的溫度環(huán)境。人和大多數(shù)哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度在37℃左右。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力比對高溫強(qiáng)。94.1.1溫度細(xì)胞培養(yǎng)在39～40℃中1h，即會受到一定損傷，但仍能恢復(fù)。當(dāng)在41～42℃的溫度條件下培養(yǎng)1h，細(xì)胞則會受到嚴(yán)重?fù)p傷，但不致于全部死亡，部分仍可能恢復(fù)。當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時，細(xì)胞大多死亡。溫度低于正常范圍的環(huán)境，總的來說，只要溫度不低于0℃時，低溫只能抑制細(xì)胞代謝，并無傷害作用。

104.1.2pH細(xì)胞內(nèi)、外pH調(diào)節(jié)是哺乳動物細(xì)胞和機(jī)體生存的基本條件。pH不僅對維持離子平衡，而且對保持細(xì)胞的最佳酶功能狀態(tài)和激素及生長因子對細(xì)胞表面受體的親和力都很重要。114.1.2pH大多數(shù)培養(yǎng)液設(shè)計的pH為7.0～7.4，最適宜是7.2，不同的細(xì)胞類型可能有一個小的最適pH變化范圍，細(xì)胞能夠耐受pH在這個范圍內(nèi)的偏離，大多數(shù)細(xì)胞能耐受的培養(yǎng)液pH范圍為6.8～7.6，超出這一范圍會致死細(xì)胞。124.1.3滲透壓滲透壓；260－320mOsm/kg適用于大多數(shù)細(xì)胞。134.1.4氣相O2(oxygen)參與細(xì)胞的能量代謝，為細(xì)胞生命活動提供能量；CO2(carbondioxide)主要與維持培養(yǎng)液的酸堿度有直接關(guān)系。大多數(shù)體外培養(yǎng)的氣相環(huán)境為含5％的CO2和95％空氣的混合氣體，其中氧濃度為21％[21.3kPa(160mmHg)]。必要時，可通人N2以稀釋O2，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱內(nèi)O2的濃度。

144.1.5生長基質(zhì)

在體內(nèi)條件下，大部分細(xì)胞貼附于結(jié)締組織、基膜或礦物基質(zhì)(如骨組織)。僅有血液、淋巴和其他液體內(nèi)的細(xì)胞能夠在懸浮狀態(tài)下生長。

多聚賴氨酸纖維連接蛋白層粘連蛋白膠原親玻粘連蛋白韌粘素人工膜飼養(yǎng)層154.2動物細(xì)胞體外培養(yǎng)方法4.2.1原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)4.2.2動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法4.2.3動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)164.2.1原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)大多數(shù)體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞都需要貼附于適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上才能生長，細(xì)胞的這種特性叫做貼壁依賴性(anchorage-dependent)。依據(jù)細(xì)胞的生長是否需要貼壁，動物細(xì)胞體外培養(yǎng)又可分為兩類：貼壁培養(yǎng)(adherentculture)和懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)。174.2.1原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

在動物細(xì)胞體外培養(yǎng)中，按照培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng)，而將體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)或稱初代培養(yǎng)(primaryculture)和傳代培養(yǎng)(subculture)，傳代培養(yǎng)又稱繼代培養(yǎng)(secondaryculture)。184.2.1原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是從機(jī)體取得材料開始，將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物，直到第一次傳代前的這一培養(yǎng)過程。原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物的結(jié)構(gòu)形式分為兩種，一種是利用小塊組織或稱為組織塊(tissueblock)進(jìn)行培養(yǎng)，另一種是將機(jī)體組織分散后制成單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)（酶消化法）。

194.2.1.1原代培養(yǎng)組織塊原代培養(yǎng)204.2.1.1原代培養(yǎng)組織塊原代培養(yǎng)214.2.1.1原代培養(yǎng)組織塊原代培養(yǎng)224.2.1.1原代培養(yǎng)離散細(xì)胞原代培養(yǎng)

在組織消化中，常用的消化酶包括胰蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、裂解酶及鏈霉蛋白酶的粗制品等。這些酶既可單獨(dú)使用，又可多種聯(lián)合使用。因為粗制品?；祀s有其他蛋白酶，所以粗制品通常比精制品更有效，而精制品更具有特異性，并且毒性小。胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶解離效果較強(qiáng)，但會造成細(xì)胞損傷；相反，膠原酶和裂解酶解離效果較弱，但對細(xì)胞損傷較小。透明質(zhì)酸酶可以與膠原酶合用以消化細(xì)胞間基質(zhì)。脫氧核糖核酸酶可用來分解由破碎細(xì)胞釋放的DNA，因為DNA可減弱蛋白水解作用，并促進(jìn)蛋白再聚合。23取材(取鼠胚)1）用引頸法殺死動物2）浸入75％酒精中5分鐘消毒3）開腹取材242526單細(xì)胞分離胰蛋白酶法適用消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、肝、腎等鈣離子、鎂離子、血清等都對其有抑制作用。27細(xì)胞計數(shù)接種培養(yǎng)284.2.1.1原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)注意事項

雖然各種細(xì)胞培養(yǎng)需要滿足不同的條件，但有幾種條件是大多數(shù)原代培養(yǎng)共同需要的：①在取材時需去除脂肪和壞死的組織；②為減小對組織的損傷，需用鋒利的器具；③適度離心以去除用于解離的酶；④由于原代培養(yǎng)組織細(xì)胞的存活率很低，故用于原代培養(yǎng)的細(xì)胞的密度應(yīng)高于正常的傳代培養(yǎng)的細(xì)胞密度；⑤營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基如Ham'sFl2比單一的培養(yǎng)基(如，Eagle'sMEM)更可??；⑥胚胎組織在原代培養(yǎng)中更易分離，細(xì)胞較易存活，增殖速度較快，故比成年組織更可取。

294.2.1.2傳代培養(yǎng)隨著原代培養(yǎng)物培養(yǎng)時間的延長、細(xì)胞分裂增殖的進(jìn)行，培養(yǎng)物體積或密度會越來越大，一方面可能會長滿培養(yǎng)空間，另一方面分裂增殖的細(xì)胞會互相接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度逐漸減慢甚至停止。30接觸抑制定義：細(xì)胞從接種到長滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。314.2.1.2傳代培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代培養(yǎng)(passageculture)。原則上，傳代是以原代培養(yǎng)物帖壁生長長滿培養(yǎng)器皿的生長面或者在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞密度足夠大時進(jìn)行，但傳代的具體時間并沒有固定的時間，操作者可以根據(jù)具體情況安排傳代時間。但是，提前或推后傳代都不可取，尤其是后者。

324.2.1.2傳代培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)(1)原代培養(yǎng)物或傳代細(xì)胞形成細(xì)胞單層后，倒掉舊培養(yǎng)液。(2)用PBS或PE(含有0.02%EDTA的PBS)洗細(xì)胞單層1～2次，以洗去死細(xì)胞和殘存的培養(yǎng)液。(3)消化：0.25%胰蛋白酶溶液和0.02%的EDTA37℃條件下消化5～15min(4)消化完成時，吸去或者傾出消化液，立即加入蛋白酶抑制劑或者有血清培養(yǎng)液。334.2.1.2傳代培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)(5)離心(1000r／min，5min)，除去上清含酶溶液。(6)用培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。(7)接種在新的培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。一般接種在兩個或者多個培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。有時候，傳代僅為了使培養(yǎng)物經(jīng)歷并適應(yīng)傳代處理過程，在培養(yǎng)物細(xì)胞數(shù)量不大的情況下，傳代時還只是接種在一個培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。(8)分別補(bǔ)加培養(yǎng)液后，送入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

34細(xì)胞貼壁過程35細(xì)胞計數(shù)原理

細(xì)胞計數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/毫升表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺盼蘭(trypanblue)染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。36細(xì)胞計數(shù)儀器、用品與試劑1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數(shù)板、試管、吸管

2、試劑：0.4％臺盼蘭(臺盼蘭0.4克加雙蒸水至100ml)3、材料：細(xì)胞懸液(細(xì)胞懸液的制備：用毛吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一小試管中，加入1滴臺盼藍(lán)染液（0.4％），混勻，靜置2－3min,活細(xì)胞不會被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。)37細(xì)胞計數(shù)操作步驟

1、將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，然后按下式計算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104/ml38細(xì)胞計數(shù)要點(diǎn)：

1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。

39細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù)要點(diǎn)：

3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；4.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。5.操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。40細(xì)胞計數(shù)初學(xué)者易犯的錯誤：

1.計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。2.滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。3.滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。414.2.1.2傳代培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)適用細(xì)胞：血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞(包括雜交瘤細(xì)胞)以及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。方法：不用消化液停止搖動吸出部分細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)液

424.2.2動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法體外培養(yǎng)這門技術(shù)，說到底就是將活的組織、細(xì)胞、器官或者微小個體放在一個不會被其他微生物污染的培養(yǎng)器皿內(nèi)而維持其生存、生長的技術(shù)。既然如此，由于擬培養(yǎng)的對象不同、擬放置的培養(yǎng)器皿不同以及維持生存與生長的方法不同，體外培養(yǎng)就可分為許多不同的方法或技術(shù)。434.2.2動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法灌注小室培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法44單蓋玻片懸滴培養(yǎng)法①將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開②將待培養(yǎng)的組織塊鋪展于培養(yǎng)液中央③將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封④貼壁24小時內(nèi)，細(xì)胞就能從組織塊四周游走適用于組織量少的原代培養(yǎng)45單玻片的再培養(yǎng)1）用消毒剃須刀刮去蓋玻片四周的石蠟2）用鑷子小心揭開蓋玻片，培養(yǎng)物面朝上，放入培養(yǎng)皿內(nèi)。3）用白內(nèi)障刀切除生長暈周圍部分，留下方形培養(yǎng)物，并切成小塊。4）將小塊在含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中再漂洗，移入另一含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行再培養(yǎng)。46雙蓋玻片懸滴培養(yǎng)法方法和前面基本相同。不同點(diǎn)：取一載體蓋玻片，在其上滴一滴大小適當(dāng)?shù)南菊麴s水。將帶有組織塊的蓋玻片的無組織一面貼到載體蓋玻片上，借助水滴的擴(kuò)展，將兩張蓋玻片貼牢在一起。培養(yǎng)兩天后，將帶有培養(yǎng)物的蓋玻片取下，漂洗后將其貼于一張新的載體蓋玻片上，繼續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：1）容易換片。2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中，不需移動位置，有利于組織分化。47培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法器材：培養(yǎng)瓶材料：組織塊或單層細(xì)胞方法：單層細(xì)胞用消化培養(yǎng)法，將組織消化成為細(xì)胞懸液后培養(yǎng)組織塊以間距0.5cm均勻擺置在瓶壁上，翻轉(zhuǎn)瓶，注入適宜培養(yǎng)液，37℃恒溫2—4小時，待貼附后，再翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。48培養(yǎng)瓶（傳代）培養(yǎng)49旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法器材：旋轉(zhuǎn)管，旋轉(zhuǎn)瓶由于旋轉(zhuǎn)作用，組織塊和細(xì)胞交替地與培養(yǎng)基和空氣直接接觸。50灌注小室培養(yǎng)法基于懸滴培養(yǎng)建立的方法，可用來連續(xù)觀察的細(xì)胞的動態(tài)變化51培養(yǎng)板培養(yǎng)法用于對培養(yǎng)物進(jìn)行規(guī)范的、定量的組間比較。524.3動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性由于體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細(xì)胞的生物特性有所不同。在培養(yǎng)細(xì)胞期間，要對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)性檢測。細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長狀況、營養(yǎng)液、微生物污染等方面進(jìn)行檢查。534.3動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性在細(xì)胞機(jī)能不良時，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其它顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可以變得不規(guī)則甚至失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成成纖維細(xì)胞等。可利用活細(xì)胞相差顯微鏡觀察并攝影其一般形態(tài)結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架等。544.3動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性體外培養(yǎng)的細(xì)胞，按照其生長方式大體可分為貼壁依賴性(黏附型)和非貼壁依賴性(懸浮型)兩大類。貼壁依賴性細(xì)胞分四類：成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型和多形細(xì)胞型

554.3.1細(xì)胞體外生長形態(tài)

成纖維細(xì)胞型

細(xì)胞呈梭形、長條形、多角形或不規(guī)則形，細(xì)胞之間排列疏松，有較大細(xì)胞間隙，有時也見平行排列，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等走行形式。起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)這種形式，例如成纖維細(xì)胞以及其他主要的結(jié)締組織細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎間充質(zhì)細(xì)胞等多呈此型。在體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時，經(jīng)常遇到培養(yǎng)物中出現(xiàn)成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞，因確切類型不明，一般稱之為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(fibroblast-likecell)。564.3.1細(xì)胞體外生長形態(tài)

成纖維細(xì)胞型

574.3.1貼壁依賴性細(xì)胞

5859604.3.1貼壁依賴性細(xì)胞

上皮細(xì)胞型

細(xì)胞呈扁平，形態(tài)較為規(guī)整，細(xì)胞大致為多邊形，胞體近中央處有扁圓的細(xì)胞核；細(xì)胞之間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列；當(dāng)細(xì)胞緊密排列時，細(xì)胞可為六角形或多角形，因為相互擁擠而呈現(xiàn)“鋪路石樣”上皮型細(xì)胞并不等于動物體內(nèi)上皮組織的細(xì)胞。起源于內(nèi)胚層和外胚層的細(xì)胞，體外培養(yǎng)時都有可能呈現(xiàn)上皮型。例如皮膚表皮細(xì)胞、消化管與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胰臟細(xì)胞以及上皮源性的鱗癌細(xì)胞等。614.3.1貼壁依賴性細(xì)胞

上皮細(xì)胞型624.3.1貼壁依賴性細(xì)胞

634.3.1貼壁依賴性細(xì)胞

游走細(xì)胞型

細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定，相互散在生長，一般不形成群落；細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒，常具有胞質(zhì)突起(偽足)。這類細(xì)胞在培養(yǎng)器皿壁上生長的位置不固定，?；钴S地游走或做變形運(yùn)動，速度快且方向不規(guī)則，一般不連成片。當(dāng)細(xì)胞密度增大相互連接成片時，游走受限，形狀上類似上皮型細(xì)胞或成纖維型細(xì)胞。如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝枯否細(xì)胞(Kupffercell)以及某些腫瘤細(xì)胞等。644.3.1貼壁依賴性細(xì)胞

654.3.1貼壁依賴性細(xì)胞

多形細(xì)胞型

多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，但它不像成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞那樣，不規(guī)則形態(tài)由寬扁的胞質(zhì)突起所致。其細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分組成，胞體略呈多角形，但無成纖維細(xì)胞型那樣不規(guī)則；胞突為細(xì)長形，似絲狀偽足。體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞屬于此類，細(xì)胞由神經(jīng)元本體和樹枝狀的樹突構(gòu)成。66

674.3.1非貼壁依賴性細(xì)胞

主要形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是胞體始終為球形。優(yōu)點(diǎn)：能以懸浮狀態(tài)生長的細(xì)胞，密度一般都可以較大，故培養(yǎng)的效率高。以這種方式培養(yǎng)細(xì)胞時，轉(zhuǎn)換培養(yǎng)液、補(bǔ)加培養(yǎng)液以及收獲細(xì)胞都比較容易。不足：不方便觀察。684.3.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線

生長曲線(growthcurve)反映的是培養(yǎng)細(xì)胞從接種到傳代之前的生長增殖情況?根據(jù)接種和每一次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長的變化過程，一般把每一代細(xì)胞的生長過程分為潛伏期(latentphase)、指數(shù)生長期(logarithmicgrowthphase)、平臺期(plateauphase)和衰退期(senescencephase)四個時期?694.3.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線

1潛伏期2指數(shù)生長期3穩(wěn)定期(平臺期)4衰退(亡)期704.3.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線

潛伏期特點(diǎn)：細(xì)胞有生長活動而無細(xì)胞分裂。時間：長短與細(xì)胞種類、接種的細(xì)胞密度、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。原代培養(yǎng)細(xì)胞的潛伏期長，為24～96h；細(xì)胞系的潛伏期短，為6～24h。

714.3.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線

指數(shù)生長期

指數(shù)生長期是細(xì)胞增生最活躍、細(xì)胞活力最旺盛的階段，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)增長，進(jìn)行實驗研究一般選擇此期細(xì)胞。

持續(xù)時間：3～5d

724.3.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線

平臺期(plateauphase)也稱停滯期(stagnatephase)，意即細(xì)胞不再分裂增殖，細(xì)胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動停滯。特點(diǎn)：細(xì)胞仍有代謝活動，但生長活動極為緩慢。提示：傳代。73傳代培養(yǎng)細(xì)胞增殖規(guī)律a.新傳代的單層細(xì)胞，傳代24h；b.對數(shù)中期細(xì)胞，傳代后3d，需要更換培養(yǎng)液；c.早平臺期細(xì)胞，傳代后7d，需要再次傳代。abc744.3.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線

衰退期由于沒有及時傳代，培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，代謝廢物累積，pH值降低，使細(xì)胞發(fā)生中毒性改變，甚至脫落死亡。也就是進(jìn)入了衰退期。衰退期不同于細(xì)胞的停滯期。處于停滯期的細(xì)胞可通過傳代進(jìn)行挽救，而處于衰退期的細(xì)胞以任何方法都不能阻止其向死亡方向發(fā)展。754.4培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定

污染：與培養(yǎng)無關(guān)的雜質(zhì)混入培養(yǎng)系統(tǒng)稱為污染(contamination)。包括各類微生物的污染、各種培養(yǎng)物間的交叉污染和化學(xué)物質(zhì)的污染。后兩種污染比較容易預(yù)防，而微生物污染的預(yù)防及處理就比較困難，它能直接影響后續(xù)研究工作。764.4.1培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查

培養(yǎng)液pH值偏酸→黃；中性→櫻桃紅色；偏堿→深紅色提示變黃的情形有兩種：一種是CO2；另一種情形是由于污染的細(xì)菌或霉菌的大量生長，從而使培養(yǎng)液變黃變混濁。774.4.1培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查

細(xì)胞健康狀況

良好：透明度大，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，沒有空泡，胞膜清晰，培養(yǎng)上清清澈透明不良：胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其它顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點(diǎn)。784.4.1培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查

微生物污染及其排除

微生物污染途徑a.空氣：空氣流動性大，如隔離不嚴(yán)，易造成不潔空氣的污染。b.培養(yǎng)液：配制過程發(fā)生污染。c.操作：無菌觀念不強(qiáng)。d.血清：質(zhì)量不好、檢查不嚴(yán)。e.組織樣本：避免用碘消毒、內(nèi)源性病毒。794.4.1培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查

微生物污染及其排除

細(xì)菌污染

觀察：污染較輕→培養(yǎng)液清亮；污染嚴(yán)重時→培養(yǎng)液變混濁檢測