第四章 遺傳標(biāo)記連鎖基因的分子診斷

第四章遺傳標(biāo)記連鎖基因的分子診斷

第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜

連鎖圖譜:又稱遺傳圖譜，通過(guò)遺傳重組信息得到的基因在染色體上的線性排列圖，顯示所知的基因和/或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置，而不是在每條染色體上特殊的物理位置。

它是通過(guò)計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定他們的相對(duì)距離，一般用厘摩(cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來(lái)表示。繪制遺傳連鎖圖的方法有很多，但是在DNA多態(tài)性技術(shù)未開發(fā)時(shí)，鑒定的連鎖圖很少，隨著DNA多態(tài)性的開發(fā)，使得可利用的遺傳標(biāo)志數(shù)目迅速擴(kuò)增。如果同一條染色體上的兩個(gè)基因相對(duì)距離越長(zhǎng)，那么他們減數(shù)分裂發(fā)生重組的概率將越大，共同遺傳的概率也就越小。因此可以根據(jù)他們后代性狀的分離可以判斷他們的交換率，也就可以判斷他們?cè)谶z傳圖譜上的相對(duì)距離。第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜

分子標(biāo)記（MolecularMarkers）：是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。

與其他幾種遺傳標(biāo)記—形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有:1)大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對(duì)隱性的性狀的選擇十分便利；2)基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的；3)在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；4)分子標(biāo)記揭示來(lái)自DNA的變異；5)表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無(wú)連鎖；6)檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜一、分子標(biāo)記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)VNTR又稱小衛(wèi)星DNA(MinisatelliteDNA)，是一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10-1000不等。VNTR檢測(cè)方法主要依托RFLP技術(shù)，只是對(duì)限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)必須不在重復(fù)序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點(diǎn)，則可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無(wú)關(guān)序列，通過(guò)電泳可充分顯示不同長(zhǎng)度重復(fù)序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核苷酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過(guò)分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測(cè)到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點(diǎn)，得到個(gè)體特異性的DNA指紋圖譜。

缺點(diǎn)是數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，主要集中分布在染色體著絲點(diǎn)和端粒附近，極大限制其在基因定位中的應(yīng)用。VNTR也存在實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高的缺點(diǎn)。VNTR標(biāo)記分布在染色體著絲點(diǎn)和端粒附近第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜一、分子標(biāo)記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜（二）短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)

STR：又稱為微衛(wèi)星DNA，重復(fù)單位為2-6bp，重復(fù)次數(shù)15~30次。STR遺傳符合孟得爾遺傳定律。這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因定位及克隆、遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位、遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域

由核心序列和兩側(cè)保守的側(cè)翼序列構(gòu)成，核心序列重復(fù)數(shù)的差異形成了微衛(wèi)星的高度多態(tài)性，由于重復(fù)單位簡(jiǎn)單，故又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性。STR的構(gòu)成STR的類型根據(jù)核心序列重復(fù)單元的構(gòu)成與分布，微衛(wèi)星DNA可分為三種類型：STR的分布STR的產(chǎn)生機(jī)制STR的優(yōu)點(diǎn)用微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記與其他分子標(biāo)記(包括和小衛(wèi)星DNA等)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):1)分布廣泛:微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物基因組中,不僅存在于內(nèi)含子或非編碼區(qū),也存在于編碼區(qū)及染色體上的其它任一區(qū)域,大約每隔10～50kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星。例如,豬基因組中存在著相對(duì)分子質(zhì)量約(65～100)×103拷貝的二核苷酸重復(fù)單位ACΠTG,平均每隔(30～50)kb就有一個(gè)。它的這一特點(diǎn)為在整個(gè)基因組中定位更多的基因提供了極大的方便。這是其他方法所遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及的。

STR的優(yōu)點(diǎn)2)

多態(tài)性豐富:微衛(wèi)星DNA本身重復(fù)單位數(shù)的變異是形成微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的基礎(chǔ)。這一特點(diǎn)也是RFLP和RAPD不能相比的。對(duì)于RFLP來(lái)說(shuō),它主要是由于堿基突變導(dǎo)致限制性酶切位點(diǎn)的丟失或獲得,所以大多數(shù)RFLP表現(xiàn)為二態(tài)性,雜合率低于50%,所提供的信息含量低,多態(tài)信息含量?jī)H為0.2左右。而RAPD僅表現(xiàn)出顯性遺傳,故不能直接區(qū)分雜合子和純合子。而微衛(wèi)星標(biāo)記遵循孟德爾遺傳法則,呈共顯性遺傳,因此能很好地區(qū)分純合子與雜合子。就多態(tài)性的豐富程度來(lái)說(shuō),只有小衛(wèi)星DNA可與微衛(wèi)星DNA相比,這兩者互相補(bǔ)充,將可滿足基因連鎖分析中對(duì)高多態(tài)性遺傳標(biāo)記的需要。STR的優(yōu)點(diǎn)3)

檢測(cè)方法簡(jiǎn)便:一個(gè)高度多態(tài)序列的等位基因小于500bp并且變動(dòng)范圍窄,則可以用PCR結(jié)合凝膠電泳法檢測(cè),因而微衛(wèi)星序列就很好地符合了上述標(biāo)準(zhǔn)。微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增所需樣本量極少,并且由于微衛(wèi)星序列較短,即使降解的DNA也可能包含足夠用來(lái)擴(kuò)增的微衛(wèi)星序列。隨著高效精確的基因分型自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展,微衛(wèi)星基因型檢測(cè)將會(huì)更加快捷方便。目前,微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)一般采用以互補(bǔ)于兩個(gè)側(cè)翼序列的寡核苷酸(約20nt)作為引物通過(guò)PCR擴(kuò)增,然后再用測(cè)序凝膠分離檢測(cè)其結(jié)果。一個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)一般可在24h完成,且可同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的檢測(cè)。4)中性標(biāo)記:在多數(shù)情況下,微衛(wèi)星標(biāo)記沒(méi)有任何表型效應(yīng),因而不存在對(duì)動(dòng)物個(gè)體的有害或次級(jí)效應(yīng)。STR的不足由于在不同物種中微衛(wèi)星側(cè)翼序列有所不同,針對(duì)不同物種,尤其是一些珍稀物種,往往需要進(jìn)行費(fèi)時(shí)費(fèi)力的特異性引物設(shè)計(jì)。

目前針對(duì)微衛(wèi)星的研究普遍是基于等位基因之間只存在重復(fù)單位數(shù)目差異的假設(shè),通過(guò)使用與重復(fù)序列兩端的側(cè)翼序列配對(duì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再經(jīng)電泳分離不同等位基因。但是,該方法沒(méi)有真實(shí)反映出微衛(wèi)星位點(diǎn)在DNA序列上的變異。一些研究顯示微衛(wèi)星位點(diǎn)在序列上也存在許多變異。STR的不足一些研究顯示微衛(wèi)星位點(diǎn)在序列上也存在許多變異。例如Clisson等發(fā)現(xiàn)在不同靈長(zhǎng)類物種之間,微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼序列可以發(fā)生插入或缺失,而且多為幾個(gè)相鄰堿基同時(shí)發(fā)生。而Garza等也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星的重復(fù)單位序列存在不足。這些結(jié)果反映出微衛(wèi)星進(jìn)化的復(fù)雜性,從而可能出現(xiàn)同源異型(微衛(wèi)星重復(fù)序列相同,但PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度不同)或者是異源同型(微衛(wèi)星重復(fù)序列不同.但PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度相同)。因此,單純使用PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行研究可能得出錯(cuò)誤結(jié)果。STR的不足此外,PCR擴(kuò)增受到許多因素的影響,使一些等位基因無(wú)法被擴(kuò)增出來(lái)。比如發(fā)生在引物3’端配對(duì)堿基的突變可以嚴(yán)重影響PCR效率。這些沒(méi)有被擴(kuò)增的等位基因稱為“無(wú)效基因”(nullallele)。無(wú)效基因的存在會(huì)影響結(jié)果的正確性。第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜一、分子標(biāo)記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)SNPSNP，singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性。是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,在群體中的發(fā)生頻率不小于1%。包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等轉(zhuǎn)換是指同型堿基之間G-A,T-C顛換是指發(fā)生在嘌呤與嘧啶之間A-T、A-C、C-G、G-TSinglenucleotidepolymorphismSNP依據(jù)排列組合原理一共可以有6種替換情況A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T但事實(shí)上,轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率占多數(shù),而且是C-T轉(zhuǎn)換為主，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占SNP總量的2／3左右。其原因是CpG的C是甲基化的,容易自發(fā)脫氨基形成T。SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單倍型(haplotype)，相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺傳給后代.SNPSNPSNP發(fā)生頻率在動(dòng)物基因組中分布廣泛如果隨即抽取兩個(gè)人的基因組對(duì)比,大概1000個(gè)堿基就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP如果樣本數(shù)增加,SNP會(huì)繼續(xù)增加300-600bp即會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP根據(jù)SNP在基因組中的分布位置可分為:

基因編碼區(qū)SNP(cSNP)

基因調(diào)控區(qū)SNP(pSNP)

基因間隨機(jī)編碼區(qū)SNP(rSNP)

因?yàn)榫幋a區(qū)內(nèi)的變異率占周圍序列的1/5，cSNP的總量顯著少于其他兩類SNPs。cSNP又可分為2種：同義cSNP(synonymouscSNP)和非同義cSNP(non-synonymouscSNP)SNP的分類同義cSNP：

SNP所導(dǎo)致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；非同義cSNP：指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能。這種改變常常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。位于基因調(diào)控區(qū)的SNP則會(huì)影響基因表達(dá)量的多少，因此，這兩類SNP在功能和疾病發(fā)生發(fā)展方面具有更重要的意義。SNPSNP的應(yīng)用（宏觀意義）基因組制圖中的應(yīng)用在種族遺傳學(xué)和連鎖不平衡性分析中的應(yīng)用醫(yī)學(xué)中疾病易感性研究中的應(yīng)用藥物基因組學(xué)研究中的應(yīng)用臨床耐藥研究中的應(yīng)用遺傳育種的應(yīng)用SNP的特點(diǎn)在遺傳學(xué)分析中,SNP作為一類遺傳標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用,主要源于這幾個(gè)特點(diǎn):（1）密度高:SNP在人類基因組的平均密度估計(jì)為1\1000bp,在整個(gè)基因組的分布達(dá)3×106個(gè),遺傳距離為2～3cM,密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高,可以在任何一個(gè)待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記。（2）富有代表性:某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平,因此,它們可能代表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素。SNP的特點(diǎn)（3）遺傳穩(wěn)定性:

與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比,SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化:SNP標(biāo)記在人群中只有兩種等位型(allele)。這樣在檢測(cè)時(shí)只需一個(gè)“+\-”或“全\無(wú)”的方式，而無(wú)須象檢測(cè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，微衛(wèi)星那樣對(duì)片段的長(zhǎng)度作出測(cè)量，這使得基于SNP的檢測(cè)分析方法易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。SNPs經(jīng)典檢測(cè)方法一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)方法,如:1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法PCR-RFLP;2.單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR-SSCP;3.變性梯度凝膠電泳(DGGE);4.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等SNPs高通量的檢測(cè)方法

另一大類檢測(cè)方法是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的,高通量、自動(dòng)化程度較高的檢測(cè)SNPs的方法,較為常用的有:1.DNA測(cè)序法;2.DNA芯片檢測(cè);3.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè);4.變性高效液相色譜(DHPLC)法等等第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜一、分子標(biāo)記（一）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)（二）短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)（三）單核苷酸多態(tài)(SNP)（四）拷貝數(shù)變異(CNV)

拷貝數(shù)變異(CNVs)CNVs是人類基因組內(nèi)從1kb到幾個(gè)Mb的DNA片段拷貝數(shù)的不同，包括DNA片段的刪除、插入、復(fù)制和復(fù)合多位點(diǎn)的變異等類型。以往一直認(rèn)為DNA的SNPs是遺傳變異最常見的形式，而當(dāng)前的研究表明CNVs不僅廣泛存在于正常個(gè)體，且在整個(gè)基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)至少是SNPs的3倍，可見CNVs可能在遺傳變異和物種進(jìn)化方面比SNPs起著更為重要的作用，是今后研究包括眼病在內(nèi)的人類疾病的熱點(diǎn)。CNVs定義

目前發(fā)現(xiàn)的人類基因組中CNVs的個(gè)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于～1200萬(wàn)的SNPs，但是，它們覆蓋的染色體長(zhǎng)度至少達(dá)到150Mb，這也是目前任何一種遺傳標(biāo)志都不能比擬的。另外，CNVs在染色體上的分布具有非隨機(jī)性，它與其他的基因組特征，如外顯子、可移動(dòng)元件(如Alu重復(fù)序列)等密切相關(guān)，而這些基因組特征通常是導(dǎo)致疾病發(fā)生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)之。此外，它們的分布還具有明顯的富集區(qū)和稀有區(qū)，例如人類染色體上有250Mb的區(qū)域超過(guò)50%的序列發(fā)生CNVs，而有60Mb的區(qū)域90%以上的序列位于CNV中．這些富集區(qū)主要集中在近著絲粒和亞端粒區(qū)等具有高度多態(tài)和進(jìn)化不穩(wěn)定的區(qū)域。CNVs特點(diǎn)CNVs特點(diǎn)CNVs除了具有上面提到的覆蓋范圍廣、組成形式多樣的特點(diǎn)以外，還具有其作為疾病易感標(biāo)志的三個(gè)重要特點(diǎn)--可遺傳性、相對(duì)穩(wěn)定性和高度異質(zhì)性．利用父母-子女三人同胞對(duì)(Trios)樣本分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，子女中絕大多數(shù)的CNVs遺傳自父母，這些位點(diǎn)成為遺傳性CNVs(inheritedCNVs)，而新發(fā)生的與父母染色體同源序列重合率<50%的CNV，稱為新的CNV或新的拷貝數(shù)突變(DenovoCNVs）

此外，目前的研究認(rèn)為，CNVs具有與SNPs相似程度的人種差異，即不同人群之間可能共享大部分相同的CNVs，而部分CNVs在不同人群中以不同頻率分離并有顯著性差異．CNVs具有的上述人群遺傳學(xué)特點(diǎn)，其多態(tài)性成為一種新的遺傳標(biāo)記，可以用于鑒定疾病易感基因位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析．CNVs特點(diǎn)CNV的組成形式CNVs既可以是簡(jiǎn)單的DNA結(jié)構(gòu)變化(如單一片段的擴(kuò)增、缺失、插入)，也可以是復(fù)雜的染色體擴(kuò)增、缺失和插入的各種組合形式．Redon等根據(jù)CNVs的遺傳和組成形式，將CNVs分為5類： a．缺失， b．?dāng)U增， c．同一位點(diǎn)并發(fā)的缺失與擴(kuò)增， d．多等位基因位點(diǎn)， e．復(fù)雜難以描述的位點(diǎn)．

通常擴(kuò)增比缺失更為常見，并覆蓋更大的范圍，這主要是因?yàn)槿旧w大片段缺失通常會(huì)引起更為嚴(yán)重的表型后果，難以在進(jìn)化中保留下來(lái).CNVS的幾種組成形式圖解CNV的組成形式另外一個(gè)與CNVs相關(guān)的概念是重復(fù)片段倍增(segmentalduplication，SDs)，它是指參考基因組序列中出現(xiàn)DNA片段長(zhǎng)度>1kb的兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝，不同拷貝之間的序列同源性>90%．全基因組中SDs的密度約是4%～5%，而CNVs富集區(qū)的SDs平均密度約25%，CNVs稀有區(qū)的平均密度近2%～3%．因此，CNVs和SDs的發(fā)生具有高度相關(guān)性，表明兩者可能具有相似的發(fā)生學(xué)基礎(chǔ)．目前認(rèn)為SDs也是CNVs的一種組成形式．CNVs潛在的形成機(jī)制

CNV的發(fā)生,或者說(shuō)絕大多數(shù)CNV的發(fā)生是非等位基因同源重組(non-allelichomologousrecombination,NAHR)的結(jié)果(Shaffer&

Lupski,2000;Cooperetal.,2007;Kiddetal.,2008)。也有許多學(xué)者認(rèn)為,NAHR只能解釋少量的CNV,其產(chǎn)生的機(jī)制更有可能是非同源末端連接(non-homologousendjoining,NHEJ）。轉(zhuǎn)座和反轉(zhuǎn)座也被認(rèn)為是產(chǎn)生CNV變異的重要因素之一。

CNVs影響基因表達(dá)機(jī)制

有關(guān)CNV對(duì)表型的調(diào)控作用,Beckmann等(2007)認(rèn)為可能主要通過(guò)以下幾種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn):(1)重復(fù)/缺失數(shù)目本身的劑量效應(yīng)(dosageeffect);(2)CNV改變了基因的結(jié)構(gòu),對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生影響;(3)CNV的多態(tài)影響到基因的表達(dá)水平,進(jìn)而影響到基因的外顯率;(4)CNV具有長(zhǎng)距離的調(diào)控作用,只要和基因同線,就可能對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。

盡管在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)的CNV的數(shù)量超過(guò)6,000個(gè),但只有少數(shù)的CNV覆蓋了功能基因及基因的調(diào)控因子,絕大多數(shù)CNV和表型可能無(wú)關(guān)或?qū)Ρ硇偷呢暙I(xiàn)率很低。最直接的證據(jù)是絕大多數(shù)CNV的發(fā)現(xiàn)均是源于大樣本中正常表型個(gè)體的檢測(cè)而發(fā)現(xiàn)的。CNVs影響基因表達(dá)機(jī)制

CNVS的檢測(cè)方法

a.比較基因組雜交芯片是目前檢測(cè)CNV多態(tài)性最常用的方法。b.SNP芯片是另一種有效檢測(cè)CNV的技術(shù)。c.定量PCR也可用于CNV的檢測(cè)。d.基于不同個(gè)體的DNA序列比對(duì)是檢測(cè)CNV的最直接的方法,這種方法的最大優(yōu)勢(shì)是圖譜的清晰度可以達(dá)到單核苷酸水平。但由于測(cè)序費(fèi)用的昂貴,要對(duì)一個(gè)群體的多個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序還不現(xiàn)實(shí)。CNVS與疾病CNVs通過(guò)擾亂基因活性和改變基因劑量來(lái)影響基因表達(dá)、表型差異和表型適應(yīng),從而引起疾病?；蚩截悢?shù)變異是個(gè)體之間在基因組序列差異上的一個(gè)重要源泉，是研究基因組進(jìn)化和表型差異的一個(gè)重要因素。許多關(guān)于基因拷貝數(shù)變異的研究結(jié)果表明，拷貝數(shù)變異可導(dǎo)致不同程度的基因表達(dá)差異，對(duì)正常表型的構(gòu)成及疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定作用。

遺傳性CNVs通常是某些疾病具有家族聚集性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，新的拷貝數(shù)突變可能導(dǎo)致某些散發(fā)性疾病的發(fā)生。長(zhǎng)期以來(lái),人們一直關(guān)注比較小的變異,如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。實(shí)際上,一些疾病更有可能是由于拷貝數(shù)的變異所引起的。例如,CCL3L1基因的CNVs一定程度上決定著對(duì)艾滋病病毒感染的抗性,而CCL3L1基因在SNP圖譜上則找不到變異。CNVS與疾病

通過(guò)CNV全基因組關(guān)聯(lián)分析評(píng)價(jià)新的拷貝數(shù)突變?cè)谏l(fā)性疾病中的作用。傳統(tǒng)認(rèn)為，遺傳性疾病通常是指遺傳性狀與改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能或調(diào)節(jié)的突變堿基以孟德爾遺傳方式分離。然而，臨床遺傳學(xué)家發(fā)現(xiàn)，至少有97%的疾病是散發(fā)的，而且不涉及任何基因的突變，僅僅源于CNVs。CNVS與疾病

那么散發(fā)性疾病的分子基礎(chǔ)是什么呢？目前認(rèn)為它通常是由一個(gè)染色體異?；螂[性性狀或新的顯性突變引起的．據(jù)估計(jì)新的基因組重組位點(diǎn)特異突變率介于10-6到10-4之間，至少比點(diǎn)突變率高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)．因此對(duì)于大部分散發(fā)性疾病病例來(lái)說(shuō)(甚至可能包括遺傳性疾病)，新的拷貝數(shù)突變可能是一個(gè)主要的遺傳性機(jī)制．也有可能部分散發(fā)性疾病源于分布于相同或不同位點(diǎn)的兩個(gè)不同(父母)來(lái)源的CNVs組合，而僅攜帶其中之一的個(gè)體不會(huì)發(fā)?。?/p>

因此，當(dāng)前的CNV全基因組關(guān)聯(lián)分析為研究散發(fā)性疾病的分子機(jī)制提供了一條有效路徑．CNVS與疾病

對(duì)于復(fù)雜疾病來(lái)講，由于致病性變異可能分布在不同的染色體上，因此以SNPs為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析對(duì)疾病易感位點(diǎn)的檢出能力有限，即單一位點(diǎn)的SNPs等位基因無(wú)法有效地將受累個(gè)體和健康對(duì)照區(qū)分開來(lái)．然而，對(duì)于致病性CNVs來(lái)說(shuō)，則不存在這樣的問(wèn)題．因?yàn)镃NVs引起的基因劑量改變足以改變表型．所以拷貝數(shù)變異的全基因組關(guān)聯(lián)分析更容易鑒定到致病突變．目前CNVs與SNPs研究

在與CNVs相關(guān)的病例研究中,利用SNPs卻鑒定不出病因所在的基因組區(qū)域,因?yàn)檫@些區(qū)域中的SNPs達(dá)不到所研究樣本中孟德爾遺傳規(guī)律或哈代溫博定律所要求的標(biāo)準(zhǔn)。這種現(xiàn)象在復(fù)雜多等位基因的CNVs中尤為突出,原因可能是CNVs在基因組中不斷的擴(kuò)張或收縮。目前CNVs與SNPs研究

SNP和CNV分別捕獲了基因表達(dá)的遺傳變異的83.6%和17.7%,兩種類型的變異很少重疊。目前有學(xué)者認(rèn)為，SNPs、CNVs的組成與拷貝數(shù)以及環(huán)境因子都參與疾病特定表型的產(chǎn)生，因此在進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡可能結(jié)合SNPs和CNVs基因分型結(jié)果。因?yàn)樵谌祟惢蚪M中snp的豐富性，所以,Conradetal.(2006)和McCarrolletal.(2006)推測(cè)這些snp也許可用來(lái)發(fā)現(xiàn)潛在的CNVS，如果這些CNVS影響了snp基因型分型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。目前CNVs與SNPs研究

第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系（二）基因型分析（三）通過(guò)標(biāo)記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系要構(gòu)建DNA標(biāo)記連鎖圖譜，必須建立作圖群體。建立作圖群體需要考慮的重要因素包括親本的選配、分離群體類型的選擇及群體大小的確定等。第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系(1)親本的選配:首先要考慮親本間的DNA多態(tài)性。選擇親本時(shí)應(yīng)盡量選用純度高的材料，并進(jìn)一步通過(guò)自交進(jìn)行純化。要考慮雜交后代的可育性。選配親本時(shí)還應(yīng)對(duì)親本及其F1雜種進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系(2)分離群體類型的選擇:根據(jù)其遺傳穩(wěn)定性可將分離群體分成兩大類：一類稱為暫時(shí)性分離群體，如F2、F3、F4、BC、三交群體等，這類群體中分離單位是個(gè)體，一經(jīng)自交或近交其遺傳組成就會(huì)發(fā)生變化，無(wú)法永久使用。另一類稱為永久性分離群體，如RI、DH群體等，這類群體中分離單位是株系，不同株系之間存在基因型的差異，而株系內(nèi)個(gè)體間的基因型是相同且純合的，是自交不分離的。這類群體可通過(guò)自交或近交繁殖后代，而不會(huì)改變?nèi)后w的遺傳組成，可以永久使用。第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系(3)群體大小的確定:

遺傳圖譜的分辨率和精度，很大程度上取決于群體大小。群體越大，則作圖精度越高。但群體太大，不僅增大實(shí)驗(yàn)工作量，而且增加費(fèi)用。因此確定合適的群體大小是十分必要的。a.合適群體大小的確定與作圖的內(nèi)容有關(guān)。從作圖效率考慮，作圖群體所需樣本容量的大小取決于以下兩個(gè)方面：是從隨機(jī)分離結(jié)果可以辨別的最大圖距。是兩個(gè)標(biāo)記間可以檢測(cè)到重組的最小圖距。b.作圖群體大小還取決于所用群體的類型。在分子標(biāo)記連鎖圖的構(gòu)建方面，為了達(dá)到彼此相當(dāng)?shù)淖鲌D精度，所需的群體大小的順序?yàn)镕2>RI>BC1>DH。第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜二、遺傳圖譜構(gòu)建的基本步驟（一）建立參考家系（二）基因型分析（三）通過(guò)標(biāo)記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（1）連鎖的兩點(diǎn)檢測(cè)（2）利用最大似然法估計(jì)重組率（3）似然比與連鎖分析（4）多點(diǎn)分析與基因直線排序基因重組和連鎖理論連鎖圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)是染色體的交換與重組。基因的連鎖是位于同一染色體上的基因在遺傳過(guò)程中一般傾向于維系在一起。基因的重組是通過(guò)一對(duì)同源染色體的兩個(gè)非姊妹染色單體之間的交換來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

ShCshc二分體ShCShCShCShCShCshcshcshcshcshcshCShcCShCShCShcShCshcshcshcsh四分體全部親組合占94％3％親組合3％重組合6%細(xì)胞交換F1新新新shcshcShCShCP1P294％細(xì)胞無(wú)交換重組型配子所占的比例取決于減數(shù)分裂細(xì)胞中發(fā)生交換的頻率。交換頻率越高，則重組型配子的比例越大。重組型配子最大可能的比例是50%，這時(shí)在所有減數(shù)分裂的細(xì)胞中，在兩對(duì)基因的連鎖區(qū)段上都發(fā)生交換，相當(dāng)于這兩對(duì)基因間無(wú)連鎖，表現(xiàn)為獨(dú)立遺傳。重組型配子占總配子的比例稱為重組率，用r表示。重組率的高低取決于交換的頻率，而兩對(duì)基因之間的交換頻率取決于它們之間的直線距離。重組率的值變化于完全連鎖時(shí)的0%到完全獨(dú)立時(shí)的50%之間。因此重組率可用來(lái)表示基因間的遺傳圖距，圖距單位用厘摩（centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。通過(guò)標(biāo)記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（1）連鎖兩點(diǎn)檢測(cè)

如果兩個(gè)基因座位于同一染色體上且相距較近，則在分離后代中通常表現(xiàn)為連鎖遺傳。對(duì)兩個(gè)基因座之間的連鎖關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，稱為兩點(diǎn)檢測(cè)。了解各基因座位的等位基因分離是否符合孟德爾分離比例，這是連鎖檢驗(yàn)的前提：

在共顯性條件下，F(xiàn)2群體中一個(gè)座位上的基因型分離比例為1:2:1，而BC1和DH群體中分離比例均為1:1；在顯性條件下，F(xiàn)2群體中分離比例為3:1，而BC1和DH群體中分離比例仍為1:1。檢驗(yàn)DNA標(biāo)記的分離是否偏離孟德爾比例，一般采用

2檢驗(yàn)。（2）利用最大似然法估計(jì)重組率兩個(gè)連鎖座位不同基因型出現(xiàn)的頻率是估算重組值的基礎(chǔ)。在一般的遺傳學(xué)教材中，重組值的估計(jì)是根據(jù)分離群體中重組型個(gè)體占總個(gè)體的比例來(lái)估計(jì)的。這種估計(jì)方法無(wú)法得到估計(jì)值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，因而無(wú)法對(duì)估值進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和置信區(qū)間估計(jì)。采用最大似然法進(jìn)行重組率的估計(jì)可解決這一問(wèn)題。最大似然法以滿足其估計(jì)值在觀察結(jié)果中出現(xiàn)的概率最大為條件。在人類遺傳學(xué)研究中，由于通常不知道父母的基因型或父母中標(biāo)記基因的連鎖相是相斥還是相引，因而無(wú)法簡(jiǎn)單地通過(guò)計(jì)算重組體出現(xiàn)的頻率來(lái)進(jìn)行連鎖分析，而必須通過(guò)適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)模型來(lái)估算重組率，并采用似然比檢驗(yàn)的方法來(lái)推斷連鎖是否存在，即比較假設(shè)兩座位間存在連鎖（r<0.5）的概率與假設(shè)沒(méi)有連鎖（r=0.5）的概率。通過(guò)標(biāo)記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（3）似然比與連鎖分析

這兩種概率之比可以用似然比統(tǒng)計(jì)量來(lái)表示，即L（r）/L（0.5），其中L（）為似然函數(shù)。為了計(jì)算方便，常將L（r）/L（0.5）取以10為底的對(duì)數(shù)，稱為L(zhǎng)OD值。要確定兩對(duì)基因之間存在連鎖，一般要求似然比大于1000:1，即LOD>3；要否定兩對(duì)基因連鎖的存在，則要求似然比小于100:1，即LOD<2。在其它生物遺傳圖譜的構(gòu)建中，似然比的概念也用來(lái)反映重組率估值的可靠性程度或作為連鎖是否真實(shí)存在的一種判斷尺度。通過(guò)標(biāo)記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（4）多點(diǎn)檢測(cè)對(duì)多個(gè)座位進(jìn)行聯(lián)合分析，利用多個(gè)座位間的共分離信息來(lái)確定它們的排列順序，也就是多點(diǎn)檢測(cè)。

在未知各基因座位于哪條染色體的情況下：兩點(diǎn)檢測(cè)，根據(jù)兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)的結(jié)果，將那些基因座分成不同的連鎖群，然后再對(duì)各連鎖群（染色體）上的座位進(jìn)行多點(diǎn)連鎖分析。

在一條染色體上，經(jīng)過(guò)多次多點(diǎn)測(cè)驗(yàn)，就能確定出最佳的基因排列順序，并估計(jì)出相鄰基因間的遺傳圖距，從而構(gòu)建出相應(yīng)的連鎖圖。通過(guò)標(biāo)記間的連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜第一節(jié)分子標(biāo)記與連鎖圖譜三、禽畜基因組計(jì)劃進(jìn)展（一）雞基因組計(jì)劃（二）牛基因組計(jì)劃（三）綿羊基因組計(jì)劃（四）豬基因組計(jì)劃第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

基因定位→QTL定位

什么是QTL？什么是數(shù)量性狀？第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

數(shù)量性狀（quantitativecharacters）是指在一個(gè)群體內(nèi)的各個(gè)體間表現(xiàn)為連續(xù)變異的性狀，如動(dòng)植物的高度或長(zhǎng)度等。數(shù)量性狀較易受環(huán)境的影響，在一個(gè)群體內(nèi)各個(gè)個(gè)體的差異一般呈連續(xù)的正態(tài)分布，難以在個(gè)體間明確地分組。第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

QTL(quantitativetraitlocus)，數(shù)量性狀座位或者數(shù)量性狀基因座，它指的是控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置。

對(duì)QTL的定位必須使用遺傳標(biāo)記，人們通過(guò)尋找遺傳標(biāo)記和感興趣的數(shù)量性狀之間的聯(lián)系，將一個(gè)或多個(gè)QTL定位到位于同一染色體的遺傳標(biāo)記旁，換句話說(shuō)，標(biāo)記和QTL是連鎖的。近幾年QTL定位應(yīng)用的較為廣泛，在人類基因上與疾病有關(guān)的基因定位甚多。一、QTL定位的原理第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

二、QTL定位方法（一）候選基因（二）基因組掃描第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

二、QTL定位方法（二）基因組掃描1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1)近交系間或存在差異的群體間雜交（也稱異化群體）2)遠(yuǎn)交群體的雜交第二節(jié)基因定位的技術(shù)方法

近交系（inbredline）：在動(dòng)、植物中，通過(guò)親代與子代重復(fù)雜交若干代而獲得的遺傳型相對(duì)純一的純系。近交系中，個(gè)體的性狀會(huì)逐步趨于穩(wěn)定一致，然而其生活力則降低。指隨著反復(fù)連續(xù)地近親交配，具有不同性狀的個(gè)體進(jìn)行分離，成為基因純合體系統(tǒng)。最終完成的