分子生物學(xué)：蛋白質(zhì)的生物合成-翻譯

蛋白質(zhì)的生物合成

------翻譯

第一節(jié)蛋白質(zhì)合成體系第二節(jié)蛋白質(zhì)的合成過(guò)程第三節(jié)蛋白質(zhì)定位一、概述

參與蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)原料：20種氨基酸模板：mRNA（messengerRNA,信使RNA）運(yùn)載體：tRNA（transferRNA,轉(zhuǎn)移RNA）場(chǎng)所：核蛋白體（rRNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成)

（ribosomalRNA,核蛋白體RNA）

其他：蛋白質(zhì)因子、酶類(lèi)、ATP、GTP、無(wú)機(jī)離子等合成方向：N→C端第一節(jié)蛋白質(zhì)合成體系的重要組分一、mRNA和遺傳密碼二、tRNA三、rRNA和核糖體一、mRNA和遺傳密碼mRNA由DNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄合成，攜帶著DNA的遺傳信息，是遺傳信息的傳遞者。mRNA分子中四種不同堿基(A、G、C和U)構(gòu)成特定順序決定蛋白質(zhì)分子中20種AA所構(gòu)成的序列。mRNA只占細(xì)胞RNA的5%,種類(lèi)多,壽命短,更新快.大量實(shí)驗(yàn)證明mRNA上相鄰三個(gè)堿基編碼一種AA，因而被稱為堿基三聯(lián)體或密碼子(tripletcoden)。1.信使RNAmRNA分子上從5

至3

方向，由AUG開(kāi)始，每3個(gè)核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼。起始密碼(initiationcoden):AUG終止密碼(terminationcoden):UAA，UAG，UGA

數(shù)量：64（43）從mRNA5

端起始密碼子AUG到3

端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開(kāi)放閱讀框架(openreadingframe,ORF)。AUG，AUA，AUU真核生物的線粒體中的起始密碼子PPPmG-5

3

ORF起始密碼子起始密碼子

原核細(xì)胞中數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因常串聯(lián)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，為多順?lè)醋?polycistron)

。PPP5

3

蛋白質(zhì)非編碼序列核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)起始密碼子終止密碼子編碼序列原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)ORFORFORF非編碼序列核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)起始密碼子終止密碼子編碼序列PPPmG-5

3

蛋白質(zhì)

真核mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)，為單順?lè)醋?singlecistron)

。

真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)原核生物和真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)

⑴密碼子的方向性(Direction)

密碼子的閱讀方向及它們?cè)趍RNA由起始信號(hào)到終止信號(hào)的排列方向均為5

-3’，與mRNA鏈合成時(shí)延伸方向相同。

2.密碼子的特點(diǎn)(2)密碼子的基本通用性(universal)

對(duì)于高等、低等生物都適用，但陸續(xù)在動(dòng)物和酵母的線粒體以及草履蟲(chóng)、腺病毒中發(fā)現(xiàn)例外：如在人線粒體中AUA、AUU不在編碼Ile，而是翻譯起始信號(hào)；AGA、AGG不再編碼Arg，而成為終止信號(hào)；密碼的通用性進(jìn)一步證明各種生物進(jìn)化自同一祖先。(3)密碼子的簡(jiǎn)并性(degeneracy)

僅甲硫氨酸、色氨酸只有一個(gè)密碼子。其余氨基酸有2、3、4個(gè)，甚至多至6個(gè)三聯(lián)體為其編碼。一個(gè)氨基酸可以有幾個(gè)不同的密碼子，編碼同一個(gè)氨基酸的一組密碼子稱為同義密碼子。這種現(xiàn)象稱為密碼子的簡(jiǎn)并性。(4)密碼子的連續(xù)性

從正確起點(diǎn)開(kāi)始至終止信號(hào)，密碼子的排列是連續(xù)的。既不存在間隔（無(wú)標(biāo)點(diǎn)），也無(wú)重疊。⑸密碼子的擺動(dòng)性（wobble）如丙氨酸：GCU，GCC，GCA，GCG，只第三位不同，顯然密碼子的專一性基本取決于前兩位堿基，第三位堿基有較大靈活性。這種現(xiàn)象稱為密碼的擺動(dòng)性或變偶性。擺動(dòng)配對(duì)密碼子、反密碼子配對(duì)的擺動(dòng)現(xiàn)象tRNA反密碼子第1位堿基IUGACmRNA密碼子第3位堿基U,C,AA,GU,CUG次黃嘌呤核苷酸

在蛋白質(zhì)合成中，起著運(yùn)載氨基酸的作用，按照mRNA鏈上的密碼子所決定的氨基酸順序?qū)被徂D(zhuǎn)運(yùn)到核糖體的特定部位。

同功受體tRNA:

一種氨基酸可以有一種以上tRNA作為運(yùn)載工具。把攜帶相同氨基酸而反密碼子不同的一組tRNA稱為同功受體tRNA.反密碼子

tRNA分子上三個(gè)特定的堿基組成一個(gè)反密碼子，位于反密碼子環(huán)上。二、tRNA結(jié)構(gòu)及功能:*tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)——倒L形*tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。tRNA與多肽合成的有關(guān)位點(diǎn)

3’端-CCA上AA接受位點(diǎn)識(shí)別氨酰-tRNA合成酶位點(diǎn)

(倒L中部的DHU臂和反密碼環(huán)氨基酸臂參與這一作用)核糖體識(shí)別位點(diǎn)

(倒L中部的TΨC環(huán)與此有關(guān))反密碼子位點(diǎn)（識(shí)別mRNA上的密碼子）氨基酰-tRNA的表示法：氨基酸名稱-運(yùn)載特異的氨基酸具體作用i起始e延長(zhǎng)tRNA丙氨酰tRNA：ala-tRNAala精氨酰tRNA：arg-tRNAarg甲硫氨酰tRNA：met-tRNAmet起始密碼子AUG編碼的met由tRNAimet(真核)

tRNAemet表示肽鏈延長(zhǎng)中加入的甲硫氨酸

⑵與mRNA結(jié)合部位—反密碼子部位(tRNA的接頭作用)3’5’ICCA-OH5’3’CCA-OHGGCCCG密碼子與反密碼子的閱讀方向均為5‘

3’，兩者反向平行配對(duì)。tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA鏈上的密碼子相識(shí)別，把所帶氨基酸放到肽鏈的一定位置。

⑴3’端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。tRNA有兩個(gè)關(guān)鍵部位

核糖體是由幾十種蛋白質(zhì)和幾種rRNA組成的亞細(xì)胞顆粒。核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。核糖體的存在形態(tài)有三種：?jiǎn)魏颂求w、多核糖體和核糖體亞基。

真核生物：游離核糖體或與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合原核生物：游離核糖體或與mRNA結(jié)合成串狀的多核糖體(提高翻譯效率)。核糖體亞基的聚合與解聚與Mg2+濃度有關(guān)三、rRNA及核糖體1、核糖體的組成細(xì)菌核糖體真核生物核糖體P位和A位，二者緊密連接，各占一個(gè)密碼子的距離。P位：結(jié)合起始的氨酰-tRNA和肽基-tRNAA位：結(jié)合新?lián)饺氲陌滨?tRNA。PA5’3’2.核糖體存在兩個(gè)重要的tRNA的結(jié)合部位（大腸桿菌）P位上肽酰-tRNA上的羧基與進(jìn)入A位的氨酰-tRNA上的氨基形成新的肽鍵

P位上tRNA成為無(wú)負(fù)載的tRNA

核糖體移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離，A位上的肽酰-tRNA又回到P位，A位又空，再進(jìn)行下一次循環(huán)。

大腸桿菌由一定數(shù)目的單個(gè)核糖體與一個(gè)mRNA分子結(jié)合而成的念珠狀結(jié)構(gòu)。每個(gè)核糖體可獨(dú)立完成一條肽鏈的合成，所以在多核糖體上可以同時(shí)進(jìn)行多條肽鏈的合成，提高了翻譯的效率。3.多核糖體除了以上提到的氨酰-tRNA合成酶外，重要的酶還有轉(zhuǎn)肽酶、轉(zhuǎn)位酶等；在肽鏈合成的起始、延伸和終止過(guò)程有許多蛋白因子參與。四有關(guān)的酶和蛋白因子起始因子(initiationfactors，IF)，包括IF1、IF2、IF3；延伸因子(elongationfactors，EF)，有EF-T(

EF-Ts,EF-Tu)，EF-G；釋放因子(releasefactors，RF)，包括RF1、RF2。

第二節(jié)蛋白質(zhì)的合成過(guò)程（以E.coli為例）

一、氨基酸的活化

二、肽鏈合成的起始

三、肽鏈的延伸

四、肽鏈合成的終止與釋放

五、真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成

六、肽鏈合成后加工和折疊一、氨基酸的活化氨基酸在摻入肽鏈前必須活化，在胞液中進(jìn)行。氨基酸的活化是指各種參加蛋白質(zhì)合成的AA與攜帶它的相應(yīng)的tRNA結(jié)合成氨酰-tRNA的過(guò)程?；罨磻?yīng)在氨酰-tRNA合成酶的催化下進(jìn)行。氨基酰-tRNA合成酶ATPPPiMg2+－O~AMP·酶tRNA-OHAMP＋酶

氨基酸的活化形式 氨基酰－tRNA

氨基酸的活化部位

α－羧基

連接方式 酯鍵

活化耗能

2個(gè)~P氨基酸活化的總反應(yīng)式是：氨基酸+ATP+tRNA+H2O

氨酰-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRNA合成酶20種氨基酸中每一種都有各自特異的氨酰-tRNA合成酶。氨酰-tRNA合成酶具有高度的專一性，它既能識(shí)別相應(yīng)的氨基酸，又能識(shí)別與此氨基酸相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)tRNA分子；即使AA識(shí)別出現(xiàn)錯(cuò)誤，此酶具有水解功能，可以將其水解掉。這種高度的專一性保證了氨基酸與其特定的tRNA準(zhǔn)確匹配，從而使蛋白質(zhì)的合成具有一定的保真性。SD序列(Shine-Dalgarnosequence)

原核生物mRNA起始密碼子AUG上游約8-13個(gè)核苷酸處，有4-9個(gè)核苷酸組成的富含嘌呤的一致序列，以…AGGA…為核心，也叫做核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomalbindingsite,RBS)二、肽鏈合成的起始

SD序列1起始密碼子的識(shí)別多肽合成起始信號(hào)的密碼子為甲硫氨酸的密碼子(AUG)，而在大腸桿菌中,起始密碼子AUG所編碼的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸。fMet-tRNAf的形成Met-tRNAf+N10-甲酰FH4fMet-tRNAf+FH4甲?；刚婧松铮篗et-tRNAMet。真核生物無(wú)甲基化過(guò)程，起始氨基酸是Met,起始tRNA為Met-tRNAMetfMet-tRNAifMetIF-3mRNA在小亞基定位結(jié)合AUG5'3'mRNAmRNA與小亞基的結(jié)合依賴于：

SD序列與16SrRNA3’端部分序列的互補(bǔ)2蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的形成IF-2GTPfMet-tRNAifmet

結(jié)合到小亞基IF-3AUG5'3'核蛋白體大亞基結(jié)合，起始復(fù)合物形成50SIF-3IF-1AUG5'3'IF-2GTPIF-3IF-1AUG5'3'GDP＋PiIF-2mRNA50S在肽鏈合成起始時(shí)，首先是核糖體小亞基與mRNA上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別結(jié)合，然后，fMet-tRNAifmet

結(jié)合到小亞基，其次，大亞基與小亞基結(jié)合，形成完整的核糖體(70S起始復(fù)合物)。

新的氨酰-tRNA進(jìn)入A位。需要消耗GTP，并需EF-Tu(熱不穩(wěn)定),EF-Ts(熱穩(wěn)定)兩種延伸因子。

EF-Tu-GTP+下一個(gè)要進(jìn)入的氨酰-tRNA

形成復(fù)合物，將這個(gè)氨酰-tRNA送入核糖體A位，同時(shí)GTP

GDP+Pi，

EF-Tu-GDP+EF-TsEF-Tu-Ts+GDPEF-Tu-Ts+GTPEF-Tu-GTP+EF-Ts重新參與下一輪循環(huán)促進(jìn)氨酰-tRNA進(jìn)入A位與mRNA結(jié)合所有氨酰-tRNA必須與EF-Tu-GTP結(jié)合才可進(jìn)入70S核糖體，除了fMet-tRNAf

。三、肽鏈的延伸分為三步：1、進(jìn)位指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo)，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進(jìn)入核蛋白體A位。

進(jìn)位2、轉(zhuǎn)肽

在肽酰轉(zhuǎn)移酶的作用下P位點(diǎn)上fMet-tRNAf的甲酰甲硫氨酸從相應(yīng)的tRNA上解離下來(lái)，其-COOH(高能酯鍵)與剛進(jìn)入A位的氨酰-tRNA上的-NH2形成肽鍵，空載的tRNA留在P位，此時(shí)A位點(diǎn)攜帶一個(gè)二肽。5’3’PAAA-fMetAAAPfMet5’3’肽酰轉(zhuǎn)移酶肽鏈合成延長(zhǎng)階段的肽鍵形成過(guò)程轉(zhuǎn)肽肽酰轉(zhuǎn)移酶PA5’3’3、移位在EF-G(移位酶)的作用下，核糖體沿mRNA5’

3’方向移動(dòng)，每次移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離，結(jié)果使原來(lái)在A上的肽酰-tRNA移到了P位點(diǎn)，原來(lái)在P位點(diǎn)的空載的tRNA離開(kāi)核糖體，同時(shí)一個(gè)新的密碼子進(jìn)入空的A位，EF-G催化的移位過(guò)程需水解GTP提供能量。肽鏈合成從N-C。PA5’3’PAPPAAEF-GGTP移位EF-G(移位酶)轉(zhuǎn)位進(jìn)位轉(zhuǎn)肽進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)位三步為一個(gè)延伸循環(huán)，肽鏈每摻入一個(gè)氨基酸就重復(fù)一次延伸循環(huán)。肽鏈合成從N-C。

四、肽鏈合成的終止與釋放當(dāng)終止密碼子出現(xiàn)在A位時(shí)，終止因子結(jié)合在A位，肽鏈合成終止。RF1：識(shí)別終止密碼子UAA和UAGRF2：識(shí)別終止密碼子UAA和UGARF3：具GTP酶活性，激活RF1和RF2活性，協(xié)助肽鏈的釋放終止因子的結(jié)合使肽酰轉(zhuǎn)移酶活性變?yōu)樗饷富钚裕幕晦D(zhuǎn)移給A位tRNA，而轉(zhuǎn)移給H2O，并把已合成的多肽鏈從核糖體和tRNA上釋放出來(lái)，空載的tRNA隨機(jī)從核糖體脫落，該核糖體立即離開(kāi)mRNA，在RF3存在下,消耗GTP而解離為30S和50S非功能性亞基。再重復(fù)下一輪過(guò)程。

蛋白質(zhì)的合成是一個(gè)高耗能過(guò)程

AA活化2個(gè)高能磷酸鍵（ATP）肽鏈起始1個(gè)（70S復(fù)合物形成，GTP）進(jìn)位1個(gè)（GTP）移位1個(gè)（GTP）

第一個(gè)氨基酸參入需消耗3個(gè)(活化2+起始1)以后每摻入一個(gè)AA需要消耗4個(gè)(活化2+進(jìn)位1個(gè)+移位1個(gè))。蛋白質(zhì)的合成是一個(gè)高耗能過(guò)程，936個(gè)堿基的mRNA翻譯過(guò)程需要消耗多少ATP？消耗多少GTP？練習(xí)題936個(gè)堿基的mRNA，編碼的氨基酸個(gè)數(shù)了936/3=312，第一個(gè)氨基酸參入需消耗3個(gè)高能磷酸鍵：氨基酸活化消耗1個(gè)ATP的2個(gè)高能磷酸鍵，翻譯起始需要消耗1個(gè)GTP。以后每摻入一個(gè)AA需要消耗4個(gè)高能磷酸鍵：氨基酸活化消耗1個(gè)ATP的2個(gè)高能磷酸鍵，進(jìn)位消耗1個(gè)GTP，移位消耗1個(gè)GTP。共消耗：3+4×311=1247個(gè)高能磷酸鍵核糖體為80S，由60S的大亞基和40S的小亞基組成起始tRNA和氨基酸起始氨基酸為甲硫氨酸，起始tRNA表示為tRNAMet.起始復(fù)合物（eIF4A.eIF4E.P220復(fù)合物稱為帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白復(fù)合物(CBPC)）結(jié)合在mRNA5’端AUG上游的帽子結(jié)構(gòu)。真核生物每種mRNA只轉(zhuǎn)譯出一種多肽。。真核中涉及的蛋白因子較多已發(fā)現(xiàn)的真核起始因子有近12種，兩種延伸因子、一種終止因子-被稱為信號(hào)釋放因子(eRF)。五、真核生物蛋白質(zhì)的生物合成對(duì)抑制劑敏感性不同，如亞胺環(huán)己酮只作用于80S核糖體，只抑制真核生物的翻譯,白喉毒素與EF-2結(jié)合，抑制肽鏈移位。蛋白質(zhì)激酶參與真核生物蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)。真核中線粒體、葉綠體能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，其抑制劑與原核相似。1蛋白質(zhì)修飾(1)N末端的(甲酰)甲硫氨酸的切除.在去甲酰酶催化下將肽鏈合成的起始氨基酸-甲酰甲硫氨酸水解脫掉甲?；员汶逆溞纬伤璧臉?gòu)象.在氨肽酶催化下切去N末端一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。多肽鏈還未釋放時(shí)，上兩個(gè)過(guò)程已發(fā)生。而真核生物合成15-30氨基酸時(shí)，就已開(kāi)始上過(guò)程。（2）多肽鏈的水解斷裂如動(dòng)物體中蛋白酶形成的是無(wú)活性的酶原，到消化道后，水解切下一部分肽鏈，使酶原變成有活性的酶。六、肽鏈合成后的加工和折疊（3）氨基酸側(cè)鏈的修飾氨基酸側(cè)鏈的修飾包括羧化、羥化，甲基化及二硫鍵的形成等。脯氨酸、賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生羥基化作用。蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸羥基磷酸化。如糖原磷酸化酶（4）糖基化作用

使蛋白質(zhì)多肽鏈轉(zhuǎn)變成糖蛋白（N-糖苷鍵和O-糖苷鍵）。是在翻譯后的肽鏈上以共價(jià)鍵與單糖或寡糖連接而成的。（5）加輔基結(jié)合上輔基（酶）才具生物活性，如乙酰輔酶A羧化酶與生物素的結(jié)合。2.蛋白質(zhì)的折疊新生肽鏈在細(xì)胞內(nèi)特定的部位，在多種蛋白質(zhì)的幫助下卷曲成正確構(gòu)象，大多數(shù)蛋白質(zhì)的折疊是邊翻譯邊折疊的，至少有兩類(lèi)因子參與了折疊過(guò)程：酶：二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶分子伴侶：分子伴侶是細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)保守蛋白質(zhì)，可識(shí)別多肽鏈的非天然構(gòu)象，促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)在執(zhí)行功能時(shí)的結(jié)構(gòu)組分。分子伴侶第三節(jié)蛋白質(zhì)定位蛋白質(zhì)合成后需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜機(jī)制，定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細(xì)胞靶部位，這一過(guò)程稱為蛋白質(zhì)的靶向輸送或蛋白質(zhì)定位。?蛋白質(zhì)定位(proteintargeting)所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號(hào)，主要為N末端特異氨基酸序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的適當(dāng)靶部位，這一序列稱為信號(hào)序列。?信號(hào)序列(signalsequence)靶向輸送蛋白信號(hào)序列或成分分泌蛋白N端信號(hào)肽內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蛋白N端信號(hào)肽，C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列)線粒體蛋白N端信號(hào)序列（20～35氨基酸殘基）核蛋白核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-）過(guò)氧化體蛋白-Ser-Lys-Leu-（PST序列）溶酶體蛋白Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）靶向輸送蛋白的信號(hào)序列或成分

細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成都起始于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中“游離”的核糖體，一些蛋白起始合成不久便轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上繼續(xù)合成，另一些則停留在胞質(zhì)核糖體上合成。決定轉(zhuǎn)移的因素是什么？

1975年，G.Blobel依據(jù)實(shí)驗(yàn)提出了分泌蛋白的信號(hào)假說(shuō)理論：分泌蛋白的N端序列是信號(hào)序列(肽)，指導(dǎo)分泌蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，在蛋白合成結(jié)束之前信號(hào)肽被切除。一分泌蛋白的靶向輸送１.信號(hào)假說(shuō)的組成成分信號(hào)肽(signalpeptide)；

位于分泌蛋白N端，由15~35個(gè)氨基酸組成，分為N端、疏水核心區(qū)及Ｃ端。信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)：

能識(shí)別信號(hào)肽的蛋白，由６條多肽和一個(gè)7SRNA組成的復(fù)合物。信號(hào)識(shí)別蛋白受體(SRP受體或停泊蛋白DP)：

為SRP受體，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)信號(hào)肽的一級(jí)序列信號(hào)肽一級(jí)序列由疏水核心(h)、C端(c)和N端(n)三個(gè)區(qū)域構(gòu)成。15~35個(gè)氨基酸殘基組成堿性N端：帶正電荷的堿性氨基酸疏水核心區(qū)：疏