植物查爾酮合酶基因chs分子進(jìn)化與功能趨異的關(guān)系

植物查爾酮合酶基因chs分子進(jìn)化與功能趨異的關(guān)系

查爾酮合酶（chs，chaliane，ec.2.3.1.74）是黃酮和衍生物合成的第一步，也是黃色酮物質(zhì)生物合成的速度酶。這是黃酮類物質(zhì)生物合成的一種有限酶。這是由一分子香豆酸coa和三分子丙二醇（magoma）結(jié)合產(chǎn)生的4、5和7個(gè)羥基黃酮（narigeninchalianchalian）。類黃酮類物質(zhì)廣泛存在于高等植物,與植物的花色、花粉的發(fā)育以及生長(zhǎng)素的運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)。此外,類黃酮在植物防御反應(yīng)中也起到重要作用,如防UV輻射、真菌侵染以及豆科植物根瘤的形成等。豆科植物根瘤的形成就是由于真菌誘導(dǎo)CHS表達(dá),造成類黃酮積累和隨之而來的生長(zhǎng)素局部濃度過高,最后使植物根部形成膨大的根瘤。因此CHS催化的類黃酮途徑參與植物與微生物的相互作用。鑒于CHS成員在發(fā)育和環(huán)境調(diào)控中的雙重作用,CHS基因家族成員分子進(jìn)化和差異表達(dá)調(diào)控逐漸受到研究者重視。作為花色素合成的關(guān)鍵基因,CHS基因作為研究分子進(jìn)化的模式基因具有很大的優(yōu)勢(shì)。如花色表型易于觀察,花器官的顏色關(guān)系到昆蟲的授粉以及物種生存,而物種生存是分子進(jìn)化的根源。近年來,大量的CHS基因序列被克隆得到,為研究CHS基因的分子進(jìn)化和表達(dá)調(diào)控提供了依據(jù)。自然選擇和適者生存是生物各學(xué)科的交叉性問題,必須從有機(jī)體所在的生態(tài)環(huán)境、表型和分子機(jī)制等各級(jí)水平進(jìn)行綜合性的探討和研究。本文以查爾酮合酶基因?yàn)槔?結(jié)合國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該基因的研究以及作者近年來對(duì)蘭科植物CHS基因分子進(jìn)化的研究成果,對(duì)植物CHS基因家族成員的分子進(jìn)化和功能趨異以及其中潛在的自然選擇機(jī)制進(jìn)行探討。1基因貝的結(jié)構(gòu)基因冗余是植物基因組的一個(gè)基本特征。在大多數(shù)物種中,CHS基因以多基因家族形式存在。在矮牽?；蚪M中存在8～10個(gè)CHS基因。CHS基因在豆科植物中的拷貝數(shù)普遍較高,如在菜豆(Phaseolusvulgaris)和豌豆(Pisumsativum)中均發(fā)現(xiàn)了至少8個(gè)CHS基因?；蚣易宓男纬稍从诨蛑貜?fù)。基因重復(fù)形成的新成員必須受正向選擇(positiveselection),即必須對(duì)機(jī)體具有適應(yīng)性(adaptation)意義、產(chǎn)生特定的新的生物學(xué)功能才能在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中保持自身的存在。否則,伴隨著堿基插入、缺失及無義和移碼突變,自然界天然存在的突變的壓力最終會(huì)毫不留情的將其轉(zhuǎn)化為假基因,最終在序列上無法辨識(shí)。新的基因拷貝在生物進(jìn)化中有三種適應(yīng)性意義:①增加有限的基因產(chǎn)物量;②其編碼蛋白獲得新的功能或活性修飾;③使機(jī)體對(duì)該類基因的表達(dá)調(diào)控更加精確特異,其中也許伴隨著催化活性的細(xì)微變化,以便對(duì)該代謝途徑加以優(yōu)化。分子進(jìn)化后發(fā)生的功能趨異屬于后兩種情況。許多具有不同功能的基因亞家族成員或者起源于共同祖先基因的基因重復(fù),即在祖先物種中已經(jīng)發(fā)生基因重復(fù);或者起源于原有的兄弟亞家族成員的基因重復(fù),即在某個(gè)物種形成以后發(fā)生的基因重復(fù);它們共同組成該物種的超家族。如果這種進(jìn)化和起源獨(dú)立的出現(xiàn)于多個(gè)物種,即一個(gè)亞家族成員在某些物種獨(dú)立的起源于自身物種兄弟亞家族成員的基因重復(fù),稱為趨同進(jìn)化(convergentevolution),如植物CHS家族成員苯乙烯合酶(stilbenesynthase,STS),獨(dú)立起源于CHS。如果在各物種分歧以前,基因家族成員已經(jīng)分為幾個(gè)不同功能的亞家族,則稱為趨異進(jìn)化(divergentevolution),如牽牛(Ipomoeapurpurea)CHS基因家族。一般來說,趨同進(jìn)化發(fā)生的案例較少,受到的關(guān)注也比較少,趨異進(jìn)化是基因家族成員形成的主要方式。2chs家族成員功能趨同進(jìn)化的機(jī)制對(duì)不同植物CHS基因分子系統(tǒng)進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn),根據(jù)其序列相同程度,來自同一個(gè)物種的CHS基因序列往往分成幾個(gè)組。例如,在牽牛基因組中至今發(fā)現(xiàn)5個(gè)CHS基因,分別命名為CHSA、CHSB、CHSC、CHSD和CHSE。根據(jù)序列的相似程度,這5個(gè)基因分為2組。其中CHSD和CHSE形成的一組受到的選擇壓力大,形成的分支距離短;CHSA,CHSB,CHSC形成一個(gè)長(zhǎng)距離分支,說明這一組基因受到的選擇壓力小,突變發(fā)生的頻率高。根據(jù)表達(dá)譜分析,CHSD是花瓣中唯一負(fù)責(zé)花色素合成的CHS基因;而CHSE與花瓣筒組織內(nèi)花色素的合成有關(guān);CHSA、CHSB、CHSC在花器官組織中表達(dá)量很低,推測(cè)與花色素合成無關(guān)。體外酶活檢測(cè)表明,只有緩慢進(jìn)化的CHSD和CHSE可以催化柚皮苷查爾酮的合成,而CHSA、CHSB沒有典型的查爾酮合酶催化活性,進(jìn)一步揭示了牽牛CHS基因家族成員功能趨異性進(jìn)化的機(jī)制。Ito等將豌豆(Pisumsativum)的8個(gè)CHS基因根據(jù)序列差異分為3組,對(duì)它們的表達(dá)進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明也存在CHS基因表達(dá)模式與序列同源程度一致的現(xiàn)象(圖1),即序列同源程度高的基因表達(dá)模式也基本相同(包括組織特異性和環(huán)境誘導(dǎo)特異性),體現(xiàn)了序列和功能的一致性。在非洲菊(Gerberahybrida)中,確定功能的CHS有3個(gè)成員,GCHS1和GCHS3與花色素合成有關(guān),而GCHS2由于3個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的突變(T197突變?yōu)長(zhǎng),G256突變?yōu)長(zhǎng),S338突變?yōu)镮)造成底物結(jié)合和環(huán)化口袋變小,而使催化活性由CHS變?yōu)?-吡喃酮合酶(2-pyronesynthase,2-PS),不再參與類黃酮的合成。CHS家族成員STSs在松科植物、花生(Arachishypogaea)、葡萄(Vitisvat.optima.)都有報(bào)道。這一類基因可被真菌或其他逆境誘導(dǎo)表達(dá),其產(chǎn)物主要與植物抗真菌有關(guān)。STS與CHS催化的底物相同,只是中間產(chǎn)物的閉環(huán)過程中發(fā)生縮合的原子不同,所以產(chǎn)物分別為查爾酮和苯乙烯。除了2-PS和STS,CHS基因超家族成員還包括苯基乙烷合酶基因(bibenzylsynthase,BBS)、吖啶酮合酶基因(acridonesynthaseACS)、異丙基苯基酮合酶基因(phlorisovalerophenonesynthase,PVPS)以及在歐洲花楸(Sorbusaucuparia)中新發(fā)現(xiàn)的聯(lián)二苯合酶基因(Biphenylsynthase),各個(gè)成員之間具有60%左右的相似序列,執(zhí)行不同的功能。最近的研究表明,苔蘚CHS成員也分為幾個(gè)亞家族,而且表達(dá)條件特異性各異,可能是被子植物CHS基因分子序列和功能趨異進(jìn)化的前身。Jiang等對(duì)植物CHS和類CHS進(jìn)行了全面系統(tǒng)進(jìn)化分析,進(jìn)一步證明植物CHS家族成員的基因重復(fù)和功能趨異在被子植物與裸子植物分歧以前就已經(jīng)發(fā)生了?？傊?早期所證明的CHS的各種功能,如與花色相關(guān)、參與植物抗真菌等,在CHS家族成員內(nèi)部很可能是各有分工,各自負(fù)責(zé)。研究表明,各成員利用共同的底物丙二酰輔酶A,催化的都是酮聚酶縮合反應(yīng)。區(qū)別在于典型CHS利用的另一底物是香豆酰輔酶A,催化生成查爾酮,進(jìn)入花色素合成途徑;其他成員利用的另外一個(gè)底物是香豆酸衍生物,生成不同產(chǎn)物,與植物抗逆(主要為抗真菌病害)有關(guān)。3蘭科植物chs基因目前,數(shù)據(jù)庫(kù)中蘭科植物CHS基因序列發(fā)布的不多,針對(duì)基因功能和分子進(jìn)化研究更是少之又少。目前蘭科植物CHS研究主要集中在以下幾個(gè)屬,蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)、布隆蘭屬(Bromheadia)、石斛蘭屬(Dendrobium)和文心蘭屬(Oncidium)。與其他植物CHS基因一樣,蘭科植物CHS負(fù)責(zé)花色素的合成,受植物發(fā)育階段特異性的調(diào)控。最近研究表明,蘭科植物CHS基因的表達(dá)受到表觀遺傳調(diào)控,其上游啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)控制其表達(dá)從而控制植物的花色。查爾酮合酶基因在多數(shù)物種中以多基因家族形式存在。Southern雜交表明,蘭科植物CHS基因在已研究的各屬都是由3～5個(gè)拷貝的小多基因家族組成。這為精細(xì)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)。這些基因家族成員在不同蘭科物種中獨(dú)立發(fā)生,這也是基因重復(fù)-分化(duplication-divergence)的進(jìn)化意義之一。3.1布隆蘭屬chs基因的同源進(jìn)化分析通過對(duì)蝴蝶蘭(Phalaenopsishybrid)CHS基因家族成員的研究發(fā)現(xiàn),蝴蝶蘭CHS基因形成兩個(gè)亞家族,即PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3和PHCHS4聚在一起,而PHCHS5單獨(dú)形成一個(gè)較遙遠(yuǎn)的分支(見圖2)。有趣的是,取蘭科植物三個(gè)屬(蝴蝶蘭屬、石斛屬和布隆蘭屬)的CHS序列做鄰接樹,發(fā)現(xiàn)這三個(gè)屬CHS序列沒有形成屬特異性的分支,而是分為2個(gè)亞家族,其中PHCHS5、石斛蘭唯一發(fā)布的一個(gè)CHS序列(命名為DHCHS)以及布隆蘭屬CHS2序列(BFCHS2)聚在一起,形成一個(gè)分支,命名為OCHS1組(OrchidCHS1group);PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3和PHCHS4與布隆蘭屬CHS1(BFCHS1)聚在一起,形成快速進(jìn)化的分支,該分支成員突變發(fā)生的頻率高,命名為OCHS2組(OrchidCHS2group)。而且這兩組成員序列差異很大,OCHS1成員與來自其他物種的CHS序列聚在一起,進(jìn)化保守;而OCHS2成員形成一個(gè)長(zhǎng)距離的分支,游離在被分析的所有植物CHS基因之外,說明這一組高度進(jìn)化(圖2)。上述同源進(jìn)化分析表明,蘭科CHS基因在這些屬分歧發(fā)生以前已經(jīng)分化成兩個(gè)分支。從同源進(jìn)化樹看,OCHS1與親緣關(guān)系較近的百合科植物(同屬百合亞綱)CHS基因、以及禾本科CHS基因聚在一起,從祖先基因到分支形成的距離短,堿基突變頻率低,說明位于該分支的CHS基因受到的選擇壓力大;OCHS2形成的是長(zhǎng)距離分支,說明位于該分支的CHS基因受到的選擇壓力小,復(fù)制使這一分支產(chǎn)生后,堿基突變以加速方式進(jìn)行。以生物信息學(xué)軟件對(duì)蝴蝶蘭兩個(gè)亞家族成員相于對(duì)布隆蘭屬CHS直系同源基因的非同義突變頻率進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果表明蝴蝶蘭和布隆蘭兩個(gè)屬形成以后,蝴蝶蘭PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3、PHCHS4亞家族的進(jìn)化速率是PHCHS5的1.5倍。就蘭科植物來講,由于到目前為止有關(guān)查爾酮合酶基因全長(zhǎng)序列的報(bào)道僅限于上述三個(gè)屬,而且石斛蘭中僅OCHS1組CHS序列得到克隆測(cè)序,所以無法斷定石斛蘭CHS基因家族中是否有位于OCHS2分支的成員,是否蘭科植物所有屬的CHS基因都是以這種方式進(jìn)化的,這些都有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。3.2chs基因家族以上對(duì)蘭科植物CHS基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,CHS基因在蘭科植物各物種中是按照趨異進(jìn)化的機(jī)制產(chǎn)生的,即在各物種分歧以前,CHS就已經(jīng)形成了兩個(gè)亞家族。對(duì)蝴蝶蘭基因家族成員的差異表達(dá)鑒定為蘭科植物CHS基因兩個(gè)亞家族的功能趨異提供了進(jìn)一步的證據(jù)。PHCHS5是唯一在蝴蝶蘭花器官中大量表達(dá)的CHS基因,其表達(dá)的階段與花色素合成時(shí)期一致。而PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3和PHCHS4在花器官中表達(dá)量很低,與花色素合成沒有明顯的相關(guān)性。推測(cè)OCHS2成員主要負(fù)責(zé)植物的防御反應(yīng),而不是花色素的合成。序列比較結(jié)果表明,PHCHS4與蝴蝶蘭中參與植物-微生物相互作用的苯基乙烷合酶(bibenzylsynthase,BBS)有很高的同源性(核苷酸水平約97%)。苯基乙烷合酶是蘭科植物中研究比較深入的CHS超家族成員之一。在蘭科植物球莖、地下莖和根中,存在大量的二羥菲,推測(cè)應(yīng)該是酮聚化合物和丙苯(phenylpropane)代謝的聯(lián)合產(chǎn)物。以灰霉菌對(duì)蝴蝶蘭無菌幼苗進(jìn)行侵染,發(fā)現(xiàn)苯基乙烷合酶和S-腺苷甲硫氨酸水解酶mRNA水平上調(diào)最明顯,兩者共同參與二羥菲合成途徑參與蘭科植物和微生物相互作用。對(duì)克隆到的苯BBS進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)與STS序列相似,都屬于CHS超家族的成員。體外酶活分析表明,蝴蝶蘭BBS利用二羥-香豆酸底物的效率高于利用香豆酰輔酶A的效率(CHS優(yōu)先選擇香豆酰輔酶A),該酶尤其表現(xiàn)出優(yōu)先選擇m-羥基化物作為底物的特性。因此,研究發(fā)現(xiàn)的OCHS2亞家族即為BBS亞家族。OCHS1和OCHS2可能來源于祖先CHS基因的復(fù)制,正向選擇(positiveselection)使OCHS2序列發(fā)生的位點(diǎn)突變保留了下來,并且在進(jìn)化中繼續(xù)發(fā)生了更多有利于機(jī)體適應(yīng)環(huán)境的突變,最后具有了新的功能,即整個(gè)分子進(jìn)化過程是一個(gè)功能趨異性進(jìn)化的過程,目的是為了更好的適應(yīng)環(huán)境。蘭花性喜溫濕環(huán)境,很容易滋生霉菌,有多種蘭科植物與真菌共生,這是蘭科植物適應(yīng)環(huán)境的典型例證。推測(cè)早期蘭科植物的祖先就因?yàn)槠湎矞睾脻竦纳盍?xí)性而深受灰霉菌其害。由于偶然的因素如DNA復(fù)制或者輻射的原因,一個(gè)拷貝的CHS基因發(fā)生了個(gè)別堿基的突變。獲得突變拷貝的后代不僅沒有死亡,反而對(duì)灰霉菌耐受性增強(qiáng)了,這樣生物選擇的作用使這種基因型保存了下來,而且該基因不斷向有利于機(jī)體與灰霉菌相互作用的方向以高頻率發(fā)生突變,逐漸失去了原來的樣子,甚至這些突變基因還繼續(xù)發(fā)生基因重復(fù),使基因組中獲得了幾個(gè)該突變基因的拷貝。隨著進(jìn)化,CHS基因通過基因重復(fù),變成了多拷貝的基因家族。與其他許多植物物種一樣,蘭科植物祖先還要靠鮮艷的花色吸引昆蟲來授粉和繁殖,所以要保留一部分CHS基因拷貝來編碼酶,催化花色素的合成,這部分成員進(jìn)化保守,與其他植物CHS基因在序列上差異小,與高頻進(jìn)化的“兄弟”基因差別卻很大,于是CHS基因家族成員形成了現(xiàn)在的序列差異很大的兩個(gè)組,OCHS1和OCHS2。截至目前的研究來看,除了與蘭科植物同為百合亞綱的薯蕷科薯蕷屬(DioscoreaL.)植物中檢測(cè)到過苯基乙烷,苯基乙烷衍生物二羥菲僅在蘭科植物中發(fā)現(xiàn),所以推測(cè)二羥菲途徑是蘭科植物特有的。目前尚未在蘭科植物中發(fā)現(xiàn)除CHS和BBS之外的超家族成員。因?yàn)樵谑硎殞俸驼麄€(gè)百合目(Liliales)中未有BBS基因序列發(fā)布,在薯蕷屬也沒有CHS序列被克隆到,所以無法對(duì)蘭科植物和薯蕷屬植物CHS基因超家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,也無法斷定BBS在薯蕷科和蘭科之間的進(jìn)化地位。不過考慮到薯蕷屬與蘭科同屬于百合亞綱,同時(shí)百合科植物現(xiàn)有的CHSs與蘭科植物OCHS1成員序列相同程度比較高,親緣關(guān)系較近(圖2),BBS是否為百合亞綱特有也未可知。但是要推斷BBS是在蘭目植物(Orchidales)和百合目植物分歧以前還是以后出現(xiàn),還有待進(jìn)一步對(duì)百合科和薯蕷科植物BBS克隆鑒定后進(jìn)行分析。另外,對(duì)蘭目的另外一個(gè)科——水玉簪科(Burmanniaceae)CHS和BBS基因進(jìn)行克隆測(cè)序,從而深入研究CHS基因超家族成員在百合亞綱和蘭目中是否存在趨異進(jìn)化機(jī)制也是很有意義的。值得一提的是,與一般植物花器官不同,蘭科植物的萼片非綠色,而是與花瓣顏色和形狀相同。來源于OCHS1的蝴蝶蘭PHCHS5在花瓣中轉(zhuǎn)錄水平最高,但是在同樣形狀和顏色的萼片中幾乎沒有轉(zhuǎn)錄。與該結(jié)果相反,同樣來源于OCHS1組的布隆蘭BFCHS2(AF007097)在萼片中表達(dá)最高,而在花瓣中幾乎沒有表達(dá)。據(jù)此推測(cè)存在兩種可能:①雖然同樣來源于進(jìn)化保守的OCHS1,并且同時(shí)負(fù)責(zé)花色素合成,但是在不同花器官中不同成員各有分工,比如在葡萄中,CHS2和CHS3而不是CHS1負(fù)責(zé)果實(shí)表皮花青素的合成。這是基因家族成員細(xì)微分工的證據(jù),也是基因冗余的特點(diǎn),其適應(yīng)性意義可能是利于精細(xì)調(diào)節(jié);②花瓣和萼片著色的時(shí)期不一致,導(dǎo)致負(fù)責(zé)花色素合成的CHS成員在兩個(gè)器官表達(dá)時(shí)期不一致,比如,萼片著色早,所以CHS在發(fā)育早期的萼片中轉(zhuǎn)錄,而花瓣中CHS在花朵開放前表達(dá)達(dá)到頂峰。4灰霉菌的危害通過上述對(duì)三個(gè)蘭科物種CHS基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析,可以得出初步的結(jié)論:①OCHS1負(fù)責(zé)化色素合成,屬于典型CHS;OCHS2屬于BBS,參與二羥菲合成途徑。②蘭科植物中CHS和BBS來源于趨異進(jìn)化,即BBS不是在各個(gè)蘭科物種獨(dú)立發(fā)生,而是在蘭科各屬種分歧以前,祖先CHS基因已經(jīng)發(fā)生基因重復(fù),分別形成了今天負(fù)責(zé)花色素合成的CHS亞家族和負(fù)責(zé)對(duì)灰霉菌反應(yīng)的BBS亞家族。蘭科植物是開花植物中最大的家族之一,而且是單子葉植物中高度演化的一科,有6個(gè)亞科725個(gè)屬2500余個(gè)種,幾乎遍布全球,并表現(xiàn)出高度特異的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理特性。由于其奇特的葉型、花型和花色而深受人們的喜愛。隨著人民生活水平的不斷提高,對(duì)蘭花的需求量越來越大。無論北方還是南方,各地花卉市場(chǎng)都有蘭花專柜。蘭花性喜溫濕環(huán)境,如果蘭室通風(fēng)不暢很容易滋生霉菌,灰霉菌是蘭科植物最常見的一種病害,又稱花腐病。除危