人類基因組計(jì)劃的啟動(dòng)

人類基因組計(jì)劃的啟動(dòng)

1995年7月，《科學(xué)與變革》首次發(fā)布了以新測(cè)序方法（即基礎(chǔ)研究）為基礎(chǔ)的流行性碳腐敗桿菌的完整序列和組成文章。這是人類對(duì)第一個(gè)細(xì)胞微生物（即整個(gè)組建序列）的測(cè)量，表明組建序列是人類完成的。單細(xì)胞微生物基因組學(xué)研究主要源于人類基因組計(jì)劃的實(shí)施。1990年10月開始實(shí)施的人類基因組計(jì)劃,是希望用15年時(shí)間,完成人類全部23對(duì)染色體的遺傳圖譜、序列圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜,同時(shí)還對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母(Saccharomycescerevisiae)、美麗線蟲(Caenorhabditiselegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)和老鼠(Musmusculus)等5種模式生物的全基因組序列進(jìn)行測(cè)定。人類基因組約有30億個(gè)bp,編碼5-10萬(wàn)個(gè)基因,以當(dāng)時(shí)的技術(shù)水平要在15年內(nèi)完成這一計(jì)劃,是相當(dāng)艱巨的。如何采用新技術(shù)和新方法進(jìn)行DNA序列測(cè)定以及基因功能的表達(dá)模式的確定,成為人們積極探索的問題。以J.C.Venter領(lǐng)導(dǎo)的基因組研究所(TIGR)的科學(xué)家們于1991年首先提出了EST(expressedsequencetags)的概念,并利用這一方法成功地尋找和鑒定了在細(xì)胞組織中表達(dá)的基因,即通過構(gòu)建細(xì)胞組織的cDNA文庫(kù),隨機(jī)選擇cDNA克隆,利用載體引物一次測(cè)定插入片段的3′端和5′端約300~500bp,這些cDNA的部分序列即為EST,通過與GeneBank等數(shù)據(jù)庫(kù)所收集到的基因的EST比較,可鑒定出細(xì)胞組織中的功能基因。由于專門計(jì)算機(jī)軟件的發(fā)展,已能夠處理大量的DNA資料并進(jìn)行高質(zhì)量的序列組合,科學(xué)家們考慮能否借鑒EST的策略來(lái)進(jìn)行微生物的全基因組序列測(cè)定。1994年4月,JohnsHopkins大學(xué)的H.O.Smith和J.C.Venter等人合作,開始利用基因組鳥槍測(cè)序法對(duì)H.influenzae進(jìn)行全基因組序列測(cè)定,不到1年時(shí)間,即完成了這一項(xiàng)工作。接著,TIGR的Fraser等人利用這一方法用不到6個(gè)月時(shí)間也完成了尿道支原體(Mycoplasmagenitalium)的全基因組測(cè)序工作。這表明鳥槍測(cè)序法是成功的、快速準(zhǔn)確的測(cè)序策略。1認(rèn)定的堿基數(shù)為5時(shí),m鳥槍測(cè)序法基本原理是在基因組隨機(jī)文庫(kù)的基礎(chǔ)上,直接對(duì)隨機(jī)文庫(kù)的各個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,即對(duì)質(zhì)粒載體中所插入的DNA片段,同時(shí)從3′和5′兩端進(jìn)行測(cè)序,獲得大量的兩端序列已知而中間部分未知的克隆群,然后通過專門的計(jì)算機(jī)軟件將測(cè)得的序列拼接成連續(xù)的序列圖。各克隆片段中間未測(cè)定的總堿基數(shù),即缺口(gap)與測(cè)定的總堿基數(shù)有關(guān),其規(guī)律遵從泊松(poisson)公式的一個(gè)推論:P0=e-m,P0為基因組中某個(gè)堿基未被測(cè)定到的概率,m為所測(cè)定的堿基總數(shù)與基因組堿基總數(shù)相比的倍數(shù)。m越大,P0值越小。那么,當(dāng)所測(cè)定的堿基數(shù)越大,基因組中未被測(cè)定到的堿基數(shù)就越少。當(dāng)m=1時(shí),P0=e-1=0.37即基因組中有37%的堿基未測(cè)定到。當(dāng)m=5時(shí),P0=e-5=0.0067,即當(dāng)所測(cè)定的堿基數(shù)是基因組總堿基數(shù)的5倍時(shí),基因組中有0.67%的堿基未被測(cè)定到。同時(shí),當(dāng)基因組DNA總長(zhǎng)度為L(zhǎng),測(cè)定的隨機(jī)克隆的插入片段數(shù)為n時(shí),總?cè)笨陂L(zhǎng)度為L(zhǎng)e-m,每個(gè)缺口平均大小為L(zhǎng)/n?；谝陨显?單細(xì)胞微生物基因組鳥槍測(cè)序法的主要過程為:第一,基因文庫(kù)的構(gòu)建?；蛭膸?kù)的高度隨機(jī)性是測(cè)序的基礎(chǔ),構(gòu)建的文庫(kù)克隆數(shù)要達(dá)到一定數(shù)量,以保證經(jīng)末端測(cè)序的克隆片段的堿基總數(shù)大于基因組堿基總數(shù)的5倍以上。第二,測(cè)序。利用正向及反向引物,在質(zhì)粒模板上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),對(duì)所測(cè)定的克隆的插入片段通過一次反應(yīng)對(duì)3′和5′兩端測(cè)序。第三,序列拼接。將所測(cè)得的序列通過專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行序列組合,序列片段按嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)連接成數(shù)個(gè)連鎖群(contig),然后對(duì)連鎖群進(jìn)行排序和缺口填補(bǔ)。物理缺口(沒有模板DNA與之對(duì)應(yīng)的缺口)的填補(bǔ)有4種策略:印跡法、肽鏈連接法、λ克隆排序法和PCR確定連鎖群等。序列缺口用引物步移法來(lái)填補(bǔ)。在填平缺口,獲得全基因組序列之后,再用專門軟件進(jìn)行建立序列的圖形交互界面、基因組數(shù)據(jù)組合編輯等工作。與傳統(tǒng)測(cè)序法相比,鳥槍法測(cè)序省去了許多中間步驟,能快速準(zhǔn)確地對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序。傳統(tǒng)測(cè)序法是采用克隆到克隆(Clone-by-clone)的策略,即是對(duì)基因組BAC文庫(kù)中各克隆進(jìn)行測(cè)序,在每個(gè)克隆的測(cè)序過程中,先對(duì)每一個(gè)克隆進(jìn)行亞克隆,然后對(duì)每個(gè)克隆的各個(gè)亞克隆進(jìn)行直接測(cè)序,將各個(gè)亞克隆的序列拼接成一個(gè)克隆的序列圖,然后再將各克隆的序列拼接成一個(gè)連續(xù)的序列圖。這一方法中間步驟多,測(cè)序速度慢,在測(cè)序前要首先對(duì)擬測(cè)序的區(qū)域進(jìn)行物理圖譜的構(gòu)建。2堿基組成的圖譜分析在基因組序列測(cè)序完成,得到全基因組序列圖譜后,工作的重點(diǎn)即是分析這一條由數(shù)百萬(wàn)個(gè)4種堿基對(duì)線性排列而成的長(zhǎng)鏈所包含的遺傳信息。目前的工作主要是以下兩個(gè)方面:2.1回復(fù)突變體的gc結(jié)構(gòu)分析和序列分析獲得全基因組序列圖譜后,首先是分析基因組中GC含量百分比,然后考察各個(gè)區(qū)域DNA的GC含量,不同DNA區(qū)域的GC含量并非一致,GC富含區(qū)或AT富含區(qū)可能意味著該區(qū)域具有特殊功能。在H.influenzae中,GC富含區(qū)內(nèi)對(duì)應(yīng)著6個(gè)rRNA操縱子(operon)和一個(gè)隱藏的類似Mu噬菌體。在M.genitalium中,rRNA操縱子的GC含量為44%,tRNA操縱子GC含量為52%,均較其基因組平均GC含量的32%要高得多。這表明富含GC對(duì)rRNA和tRNA形成正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)是必需的。在以后的單細(xì)胞微生物基因組分析中,也發(fā)現(xiàn)類似情況。嗜熱高溫菌Aquifexaeolicus和嗜熱菌Thermotogamaritima的16S-23S-5SrRNA操縱子的GC含量比其基因組GC含量高得多,16S-23S-5SrRNA高GC含量是嗜熱細(xì)菌的特征之一。在B.subtilis的幾個(gè)GC含量低的區(qū)域,即AT富含區(qū),則含有前噬菌體或其它插入序列?？疾霥NA區(qū)域的G-C/(G+C)比率,當(dāng)這一比率發(fā)生顯著變化時(shí),表明該區(qū)域可能含有DNA復(fù)制起點(diǎn)。這在B.subtilis和古細(xì)菌M.jannaschii中均得到證實(shí)。這表明在復(fù)制的先導(dǎo)鏈和后續(xù)鏈間核苷的組成不均勻。但在T.maritima中卻沒有在具有這一特征的區(qū)域發(fā)現(xiàn)復(fù)制始點(diǎn)。通過對(duì)基因組分析,發(fā)現(xiàn)基因組內(nèi)存在重復(fù)序列、插入因子、前噬菌體和前噬菌體部分殘余DNA。B.subtilis基因組中至少包含10個(gè)前噬菌體或前噬菌體的部分殘余DNA。E.coli的基因組也發(fā)現(xiàn)多個(gè)前噬菌體?；蚪M中的前噬菌體已經(jīng)失去溶源生長(zhǎng)所必需的基因,但仍然攜帶有具有一些其它功能的基因。這表明在物種進(jìn)化過程中前噬菌體對(duì)基因水平轉(zhuǎn)移起重要作用?；蚪M中的重復(fù)單位的大小可以是由數(shù)十個(gè)bp至數(shù)百個(gè)bp不等,重復(fù)次數(shù)也是大小不同。2.2功能未知的orf分析在進(jìn)行某種生物基因組的轉(zhuǎn)錄翻譯水平分析前,首先對(duì)該物種已知的基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,考察其密碼表,設(shè)定起始密碼子和終止密碼子,然后利用專門軟件,從整個(gè)基因組中尋找開放閱讀框(ORF)即蛋白質(zhì)的可能編碼區(qū)域。在對(duì)H.influenzae的ORF的考察中獲得令人驚訝的結(jié)果,在1743個(gè)ORF中,通過與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其它物種的已知基因比較,僅有1007個(gè)ORF的功能是已知的,另有736個(gè)ORF所編碼的蛋白質(zhì)功能是未知的,這些未知的ORF一部分是在GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)找到相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列與之匹配,但蛋白質(zhì)功能未知,另一部分則是在數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到相應(yīng)的蛋白質(zhì)與之匹配。在以后的基因組ORF分析中,均有相當(dāng)一部分ORF功能未知。E.coli的4288個(gè)ORF有1630個(gè)是功能未知的,占其ORF總數(shù)的38%;而在B.subtilis的4100個(gè)ORF中,有1722個(gè)ORF功能未知,占其ORF總數(shù)的42%;即使是基因組最小的M.genitalium,在其470個(gè)ORF中,也有96個(gè)在GenBank中沒有找到任何其它生物體的已知的蛋白質(zhì)序列與之匹配。對(duì)于已知功能的ORF,根據(jù)其生物學(xué)功能,按Riley分類法進(jìn)行功能類群分類,共分為14個(gè)類群,或者按照COD法(ClustersofOrthologousGroups)將所有ORF分為18個(gè)功能類群。在ORF的起始密碼子中,使用頻率最高的是ATG,78%的B.subtilis和85%的E.coli的ORF均以ATG為起始密碼子,TTG、GTG的使用頻率較低,在B.subtilis中這兩種起始密碼子的使用頻率分別為13%和9%,在E.coli中則分別為3%和14%。另外,E.coli中還發(fā)現(xiàn)有15個(gè)ORF使用稀有起始密碼子ATT和CTG。3生物遺傳機(jī)制人們通過對(duì)基因組的研究,可以了解生物體各種代謝過程,遺傳機(jī)制和生命活動(dòng)所需的基本條件以及生物特殊功能如致病性的遺傳基礎(chǔ)。在微生物全基因組序列的測(cè)定與注釋完成后,基因組學(xué)的研究工作主要集中在以下幾方面內(nèi)容:3.1功能結(jié)構(gòu)與功能研究在全基因組測(cè)序和分析完成后,人們最關(guān)心的自然是基因的功能問題。在所有的已完成測(cè)序的單細(xì)胞微生物基因組的ORF中,都有相當(dāng)部分ORF功能是未知的,其中的一部分ORF沒有在GenBank中找到任何與之匹配的蛋白質(zhì)。如此之多的ORF所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能不為人所知,究竟是這些ORF所編碼的蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)存在的時(shí)間極短,很快就被降解掉?還是這些基因所編碼的蛋白質(zhì)及其功能一直未被人們發(fā)現(xiàn)呢?如果是后者,則表明盡管人們已經(jīng)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行近一個(gè)世紀(jì)的研究,但還有將近一半的細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)的功能仍未被人們所認(rèn)識(shí)。全基因組序列的測(cè)定與分析以及功能基因組的研究,為人們研究基因功能提供極好機(jī)會(huì)和手段。目前通過基因缺失和平行分析的方法,正對(duì)S.cerevisiaeORF的功能進(jìn)行深入研究。3.2古細(xì)菌與真核生物的親緣關(guān)系基因組學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容就是基因組間的比較研究。人們?cè)贒NA水平上對(duì)不同生物體進(jìn)行比較研究,可以了解生物物種間的進(jìn)化關(guān)系以及不同生物體生命活動(dòng)的異同。70年代以前,生物主要分為原核生物和真核生物兩大類,1977年,C.R.Wose等通過對(duì)200多種原核生物16SrRNA和真核生物18SrRNA的寡核苷酸序列分析比較,從中發(fā)現(xiàn)了生命的第三種形式——古細(xì)菌。1978年,R.H.Whittaker等提出了三原界學(xué)說(shuō),將生物分為三個(gè)原界:古細(xì)菌原界、真細(xì)菌原界和真核生物原界。按照這一學(xué)說(shuō),在生物進(jìn)化過程的早期,存在一類各種生物的共同祖先,由它分三條路線進(jìn)化分別形成三個(gè)原界。微生物全基因組的分析和基因組的比較研究,為三個(gè)原界學(xué)說(shuō)提供有力支持。通過對(duì)古細(xì)菌M.jannaschii、真細(xì)菌H.influenzae和真核生物S.cerevisiae基因組的比較研究,發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌M.jannaschii在產(chǎn)能、固氮以及細(xì)胞分裂方面的有關(guān)基因與真細(xì)菌H.influenzae有很高的同源性,而在轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)以及分泌系統(tǒng)方面的有關(guān)基因與真核生物S.cerevisiae的關(guān)系更近。這說(shuō)明古細(xì)菌與真核生物的親緣關(guān)系較與原核生物的親緣關(guān)系更近?？梢灶A(yù)計(jì)隨著越來(lái)越多的全基因組被分析和基因組間的比較研究,人們將可以重新繪制生物的系統(tǒng)進(jìn)化樹。3.3基因是否可擴(kuò)充其內(nèi)容基因組學(xué)的研究,使人們更全面深入地了解微生物致病性和致病機(jī)理。H.influenzae全基因組的分析研究發(fā)現(xiàn),編碼細(xì)胞膜上脂多糖的DNA序列中至少有9個(gè)有關(guān)的位點(diǎn)含有多個(gè)銜接重復(fù)的4核苷酸,這些重復(fù)序列的缺失或增加,可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄信號(hào)或閱讀框架的改變,使其可以逃避人體免疫監(jiān)視系統(tǒng)。病原菌N.meningitidis和H.influenzae基因組的比較研究發(fā)現(xiàn),盡管兩種病原菌均生長(zhǎng)于人的鼻咽并能引起髓膜炎,但它們的代謝方式有很大不同。H.influenzae缺乏TCA循環(huán)和ED途徑,缺少吸收離子的運(yùn)輸系統(tǒng),與N.meningitidis相比,僅有少部分的基因與電子傳遞有關(guān),但卻有相當(dāng)多的基因與氨基酸和碳水化合物的吸收有關(guān)。這表明H.influenzae更多地依賴底物磷酸化途徑而不是氧化磷酸化途徑獲取生命活動(dòng)所必需的能量。代謝途徑的顯著差別,可能與這兩種病原菌在人體寄主不同生理?xiàng)l件下而表現(xiàn)不同致病能力有關(guān)。3.4基因組織特點(diǎn)基因水平轉(zhuǎn)移即基因在兩個(gè)同時(shí)存在的物種之間轉(zhuǎn)移,但一直沒有令人信服的證據(jù)。單細(xì)胞微生物全基因組測(cè)序的完成為人們研究基因水平轉(zhuǎn)移提供了極好的研究機(jī)會(huì)?；蛩睫D(zhuǎn)移在多種微生物的基因組學(xué)研究中已得到證實(shí)?；蚪M中具有一些基因水平轉(zhuǎn)移的輔助證據(jù):基因的GC含量突然與相鄰區(qū)域的DNA序列的GC含量非常不同,基因組中殘存著插入序列的部分序列以及含有前噬菌體和前噬菌體殘存的部分序列。通過對(duì)N.Meningitidis基因組的分析,已鑒定了三個(gè)主要的基因水平轉(zhuǎn)移區(qū)域,其中兩個(gè)包含有與其致病性有關(guān)的基因。對(duì)E.coli基因組的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),其4288個(gè)ORF中的755個(gè)即與基因水平轉(zhuǎn)移有關(guān)。T.maritima是從高溫環(huán)境下的海底淤泥中分離到的一種進(jìn)化非常緩慢的嗜熱真細(xì)菌,通過對(duì)其基因組的比較研究,發(fā)現(xiàn)其52%的基因與真細(xì)菌非常相似,24%的基因與古細(xì)菌非常相似,并且其中的