高效毛細(xì)管電泳法分離檢測飼料中氟喹諾酮類藥物

高效毛細(xì)管電泳法分離檢測飼料中氟喹諾酮類藥物

氨基乙醇具有廣泛的抗菌譜、較強(qiáng)的殺菌能力、允許使用的處方和較少的副作用（陳卓宇，2002）。因此被廣泛應(yīng)用于畜禽疾病的防治。但是超劑量或長期反復(fù)使用該藥可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)等不良反應(yīng)(張俊豐和陳琳,2002)。人若長期食用含抗生素的畜禽產(chǎn)品,可產(chǎn)生耐藥性及其他不良反應(yīng)(李登赴,2008)。為了保障畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全和人類健康,已禁止喹諾酮類藥物作為藥物添加劑在商品飼料中添加(曉同,2001),但是濫用該類藥物的情況依然存在。因此建立一種同時檢測飼料中多種氟喹諾酮類藥物的方法是十分必要的。目前飼料中喹諾酮類藥物檢測主要采用高效液相色譜法(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部,2008;施杏芬等,2008;滿晨等,2005;潘葳等,2004)。但其分析時間長、運行成本較高。本研究將毛細(xì)管電泳的方法用于飼料中5種氟喹諾酮類藥物的同時檢測,通過對前處理方法、電泳條件等的研究,建立一種快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測方法。1材料和方法1.1儀器、試藥和儀器毛細(xì)管電泳儀(美國BECKMAN公司)P/ACETMMDQ,配有二極管陣列(PDA)檢測器和色譜工作站;未涂層熔融石英毛細(xì)管內(nèi)徑75μm×65cm(購自河北永年與銳伴色譜器件有限公司);WH-2型微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠);SB25-120超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司);pHS-3C精密pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠);TGL-16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);Milli-Qplus純水機(jī)等實驗室常用設(shè)備。左氧氟沙星(LVFX)、恩諾沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、環(huán)丙沙星(CIP)和諾氟沙星(NOR)標(biāo)準(zhǔn)對照品均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;檸檬酸鈉、檸檬酸、四硼酸鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉和氨水為分析純;乙腈為色譜純;實驗用水為超純水。1.2溶液的制備1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制配制30mmol/L氫氧化鈉溶液,準(zhǔn)確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)對照品各10.00mg,用30mmol/L氫氧化鈉溶液配制成1.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。置于4℃冰箱密封保存。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)工作液過濾儲備液用30mmol/L氫氧化鈉依次稀釋成濃度為25、12.5、6.25、3.12μg/mL和1.56μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,用0.22μm濾膜過濾后供分析。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用外標(biāo)法定量。1.2.3不同ph值的檸檸檬酸鈉溶液制備配制80mmol/L的檸檬酸和80mmol/L的檸檬酸鈉溶液,按一定比例混合,調(diào)pH值分別為6.3、6.5、6.7、6.9,經(jīng)0.22μm濾膜過濾,備用。1.2.4堿溶液配制提取液:乙腈-水(乙腈和純水等體積混合);30mmol/L氫氧化鈉溶液;2%氨水乙腈-水(2mL氨水用乙腈定容至100mL再與純水等體積混合)。1.3毛細(xì)管的沖洗80mmol/L檸檬酸-80mmol/L檸檬酸鈉緩沖液,pH6.5,0.5psi壓力進(jìn)樣6s,分離電壓為18kV、分離溫度為22℃下分離,檢測波長為274nm。兩次進(jìn)樣間用0.1mol/LNaOH、超純水和緩沖液分別沖洗毛細(xì)管2、3min和4min。毛細(xì)管在每次使用之前先用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、水、緩沖液沖洗各10min。1.4飼料樣品的預(yù)處理稱取飼料樣品500g,粉碎,使之全部過0.28mm篩,充分混勻,貯存于磨口瓶中備用。準(zhǔn)確稱取0.5g的飼料樣品(精確到0.001g)于具塞的離心管中,加入20mL的提取液,輕輕搖勻,在旋渦混勻器上劇烈混合3min,放氣,搖勻,常溫超聲10min,冷卻,常溫超聲10min,10000r/min離心10min,取上清液過0.22μm的濾膜,備用。2結(jié)果與討論2.1電泳分離條件的優(yōu)化2.1.1檸檬酸-檸檸檬酸鈉緩沖液分離度的確定在其他條件相同的情況下,比較磷酸-硼砂緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液對分離度的影響,分析結(jié)果表明,磷酸-硼砂緩沖液和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液分離效果較差,5組分不能完全分離;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的分離效果較好。故實驗選擇檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為實驗用的緩沖溶液。2.1.2緩沖液離子濃度對分離度的影響在其他條件相同的情況下采用不同離子濃度的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(70、75、80mmol/L和90mmol/L)進(jìn)行分離。實驗表明,緩沖液離子濃度對分離度有一定的影響。當(dāng)離子濃度為70mmol/L和75mmol/L時,左氧氟沙星和諾氟沙星不能完全分離;當(dāng)離子濃度為80mmol/L時,5組分能完全分離;但當(dāng)離子濃度增大到90mmol/L時左氧氟沙星和諾氟沙星的分離度反而下降(見圖1)。因此選擇80mmol/L作為分離的最佳離子濃度。2.1.3緩沖液ph值的影響,各組分間的分離度的測定pH是影響分離的重要因素之一,在80mmol/L檸檬酸-80mmol/L檸檬酸鈉緩沖液條件下,考察了pH為6.3、6.5、6.7、6.9對5組份分離度的影響。實驗結(jié)果表明,隨著緩沖液pH值的升高,左氧氟沙星和諾氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星間的分離度隨之增大,但是環(huán)丙沙星和恩諾沙星間的分離度卻隨之減小。當(dāng)pH=6.5時,5組分之間的分離度均滿足色譜分離的要求,且諾氟沙星和環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星之間的分離度最大,但隨后有所下降;當(dāng)pH=6.9時,5組分間的分離度達(dá)不到分離要求(見圖2)。因此選擇緩沖液pH6.3、6.5、6.7為正交實驗因子。2.1.4焦耳熱中分離效率的變化由N=μappVLeff/2DL可知,工作電壓越大,分離效率越高,但是工作電壓越大,使工作電流也越大,焦耳熱也越大,焦耳熱引起的區(qū)帶展寬增大,又會引起分離效率的下降(傅若農(nóng),1999)。本實驗考察了16、18、20kV和22kV的電壓對分離效果和遷移時間的影響,減小電壓時會延長遷移時間,但當(dāng)電壓增加到22kV時,雖然遷移時間縮短,但是5種藥物不能完全分離(圖3)。綜合考慮分度和遷移時間的因素選擇16、18kV和20kV作為正交實驗因子。2.1.5最佳的反應(yīng)效率溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性,而且影響分離的效率(陳義,2000)。一般溫度是在20~30℃之間進(jìn)行選擇的。綜合考慮各方面的因素,選擇20、22℃和25℃作為正交實驗因子。2.1.6電泳條件對分離效果的影響本實驗在之前實驗的基礎(chǔ)上通過正交實驗建立最佳電泳分離方法。根據(jù)正交設(shè)計表L9(34)(鄧勃,1995)設(shè)計了3因素3水平的正交實驗,以相鄰兩種藥物的分離度為指標(biāo),研究緩沖液pH(6.3、6.5、6.7),電壓(16、18kV和20kV),溫度(20、22℃和25℃)電泳條件對5種藥物分離效果的影響(表1)。正交實驗結(jié)果表明,除了實驗5以外,其他實驗組合中,5種藥物不能同時完全分離,只有在實驗5的電泳條件下,5種藥物能夠完全分離,即最佳的組合為:電泳緩沖液:80mmol/L檸檬酸-80mmol/L檸檬酸鈉pH6.5、運行電壓:18kV、運行溫度:22℃(圖4)。2.2方法學(xué)評價2.2.1毛細(xì)管電泳條件的測定將濃度為1.56、3.12、6.25、12.5μg/mL和25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,用正交實驗得到的最佳毛細(xì)管電泳條件依次進(jìn)行測定,以濃度(x)為橫坐標(biāo),以相應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)做回歸分析。表2的結(jié)果表明,各濃度與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.2.2電泳條件的穩(wěn)定性選擇6.25μg/mL的5種混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,利用最佳的電泳條件連續(xù)進(jìn)樣6次,考察各組分的遷移時間和校正峰面積的重復(fù)性。表3結(jié)果表明,5種藥物的峰面積RSD在2.09%~5.89%,遷移時間的RSD在1.36%~1.69%。2.2.3回收率、精密度準(zhǔn)確度的測定采用添加回收率法進(jìn)行。實驗在樣品中分別添加濃度水平為20、25μg/g和100μg/g的5種藥品的混合標(biāo)樣進(jìn)行測定?；厥章蕿閷崪y添加量與標(biāo)準(zhǔn)添加量之比。表4結(jié)果表明,方法的平均回收率為84.42%~107.5%,RSD為1.33%~9.21%。回收率和精密度能夠滿足對5種藥物的檢測要求。2.3不同提取劑的提取效果本實驗對比了乙腈-水、30mmol/L氫氧化鈉、2%氨水乙腈-水3種不同的提取劑對飼料樣品提取效果的影響(見圖5)。從圖5可以看出,乙腈-水處理的樣品的雜質(zhì)干擾較少,故最終選擇乙腈-水作為提取劑。2.4飼料加標(biāo)回收率的測定分別取雛雞料、肉中雞料、哺乳豬料和豬飼料添加不同濃度的5種藥物的混合標(biāo)樣,用乙腈-水作為提取劑,按照1.4方