度燒傷創(chuàng)面原位再生修復(fù)過程中不同活組織k19的表達

度燒傷創(chuàng)面原位再生修復(fù)過程中不同活組織k19的表達

1皮膚損傷的治療本組病例為我院2001年7月至2002年12月住院患者，其中8名男性和2名女性，年齡最低，最高年齡為39歲，平均年齡為27歲，燒傷總面積（52.2.34.64）%，i級燒傷（9.6.69）%。級燒傷的所有傷口均通過病理切割后，所有傷口均為皮膚層壞死。重點是四肢上的損傷傷口，包括5只上肢和5張下肢。全身治療方法同常規(guī)治療。局部治療:10例患者入院后常規(guī)行濕性醫(yī)療技術(shù)加外用重組人表皮生長因子衍生物(rhEGF)治療。在獲得了患者及其家屬的知情同意后,在距Ⅲ度燒傷創(chuàng)面邊緣約4cm處用手術(shù)尖刀分別切取傷后3～6d的痂下活組織、傷后25～32d的肉芽樣組織、早期再生組織(創(chuàng)面剛愈合時)以及晚期再生組織(創(chuàng)面愈合后1年),每次切取的組織塊大小約1.0cm×0.5cm×0.8cm,行常規(guī)病理學(xué)檢查以及免疫組織化學(xué)染色檢查。另外,選擇既往我院手術(shù)治療的6例外院診治3個月以上未愈的慢性皮膚潰瘍標(biāo)本做對照,取2例整形患者供皮區(qū)的正常皮膚組織作陽性對照。1樣品處理和檢測細胞表達小鼠抗人K19型單克隆抗體和過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。重組人表皮生長因子衍生物(rhEGF,2000IU/ml,商品名:金因肽)購自深圳華生元基因工程發(fā)展有限公司。美寶濕潤燒傷膏(MEBO)購自北京光明中醫(yī)燒傷創(chuàng)瘍研究所汕頭美寶制藥廠。恒冷冰凍切片機(LeicaCM1800,德國)。華利生物組織自動脫水機(江蘇)。華利自動包埋機(江蘇)。輪轉(zhuǎn)切片機(ZEISS,德國)。恒字電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海)。顯微照相系統(tǒng)(ZEISS,德國)。所有標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋,系列切片,厚度為5μm。將切片隨機分成兩組,分別用于常規(guī)病理學(xué)檢查(HE染色)和免疫組織化學(xué)染色檢查。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后,用蘇木精-伊紅染色法染色,光鏡下觀察。應(yīng)用過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)免疫組化法,以小鼠抗人K19型的單克隆抗體來檢測K19表達陽性細胞。實驗操作按試劑盒說明書進行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O237℃孵育10min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS漂洗后置于0.01mol/L,PH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中行抗原熱修復(fù),5%正常山羊血清封閉后加入一抗,4℃過夜。PBS沖洗,滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育15min,PBS漂洗,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,37℃孵育15min后DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察。細胞胞漿染成棕黃色為陽性細胞,同時設(shè)不加一抗的陰性對照。2早期再生組織病理學(xué)檢測10例患者的Ⅲ度燒傷創(chuàng)面上的脂肪組織逐漸被肉芽樣組織代替,傷后25～32d的肉芽樣組織中開始長出皮丁,以后皮丁逐步形成皮島,最后融合成片直至痊愈,愈合時間為(39.2±7.3)d。愈后不久,再生組織逐漸出現(xiàn)疤痕增生,經(jīng)抗疤痕防治1年后再生組織逐漸變成平軟而富有彈性的組織。痂下正?；罱M織常規(guī)病理學(xué)檢查為脂肪纖維組織,部分變性壞死,大量中性白細胞.淋巴細胞浸潤;肉芽樣組織常規(guī)病理學(xué)檢查為炎性肉芽組織;早期再生組織常規(guī)病理學(xué)檢查示表皮層較正常皮膚的表皮層明顯增厚,表皮腳發(fā)達;晚期再生組織常規(guī)病理學(xué)檢查示正常皮膚;慢性皮膚潰瘍組織常規(guī)病理學(xué)檢查示慢性皮膚潰瘍。正常皮膚只有表皮基底層和附屬器部分細胞表達K19。傷后3～6d,10例患者的痂下活組織均未發(fā)現(xiàn)K19表達陽性細胞。肉芽樣組織有部分細胞表達K19;早期再生組織檢測結(jié)果示:在再生表皮的中部,即位于基底膜與顆粒層之間有大量的K19表達陽性細胞,且分布廣泛而有規(guī)律;晚期再生組織檢測結(jié)果顯示:與正常皮膚類似。6例外院診治的慢性皮膚潰瘍標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)K19表達陽性細胞。3表皮胞技術(shù)的應(yīng)用角蛋白(keratin)是一種直徑為10nm左右的纖維狀蛋白,是上皮細胞的結(jié)構(gòu)蛋白和主要蛋白,在細胞內(nèi)形成廣泛的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。角蛋白作為表皮或上皮細胞特有的一類蛋白,在機體內(nèi)至少有20種不同類型,隨著細胞分化的進程,可以檢出它們逐漸表達不同的角蛋白,如有絲分裂后分化細胞表達K1、K10,短暫擴充細胞表達K5、K14,表皮干細胞表達K19,其中,K19的分子量為40kDa,是角蛋白家族中最小的成員,在皮膚中的表達隨年齡的增加而減少。自從1995年MichelM等采用雙標(biāo)記方法證明毛囊里的K19表達陽性細胞正是[3H]胸腺嘧啶核苷標(biāo)記滯留細胞以來,K19單克隆抗體就被廣泛用于檢測表皮干細胞。應(yīng)用過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)免疫組化法,以小鼠抗人K19型的單克隆抗體來檢測角蛋白19在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)過程中的表達特征時,作者發(fā)現(xiàn):⑴Ⅲ度燒傷創(chuàng)面經(jīng)濕性醫(yī)療技術(shù)加外用重組人表皮生長因子衍生物(rhEGF)治療后角蛋白19陽性細胞可以從無到有產(chǎn)生并不斷增加,以實現(xiàn)Ⅲ度燒傷創(chuàng)面原位再生修復(fù),結(jié)合相關(guān)文獻,作者認為這些K19表達陽性細胞就是表皮干細胞;相反,既往本院手術(shù)治療的6例外院診治3個月以上未愈的慢性皮膚潰瘍標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)K19表達陽性細胞,進一步證明了表皮干細胞是創(chuàng)面原位再生修復(fù)的必要條件。⑵在再生表皮的中部,即位于基底膜與顆粒層之間有大量的K19表達陽性細胞,且分布廣泛而有規(guī)律。JohesPH體外培養(yǎng)實驗表明:在沒有真皮存在時,表皮干細胞也能形成類似體內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)。由此推測表皮干細胞先是克隆性生長,達到一定數(shù)量后再從最表層開始逐漸分化成熟為其它功能細胞。⑶大量研究表明:細胞是生物形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動的基本單位,細胞間的相互作用是決定細胞命運的重要因素之一。李毅等的實驗研究就是證據(jù)之一。因此,作者認為,在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中可能存在優(yōu)勢假說,即皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個系統(tǒng)工程,許多相關(guān)細胞分泌大量的相關(guān)細胞因子,通過復(fù)雜的生物信息,直接或間接地對基因進行調(diào)控,并象網(wǎng)絡(luò)一樣相互影響。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中,當(dāng)創(chuàng)面微環(huán)境有利于表皮生長且表皮的生長占優(yōu)勢時,創(chuàng)面愈合就朝生理性愈合方向發(fā)展,最終,缺損組織完全再生;相反,當(dāng)創(chuàng)面微環(huán)境不利于表皮的生長或表皮的生長處于劣勢時,創(chuàng)面愈合就朝病理性愈合方向發(fā)展,最終,缺損組織不完全再生。由于早期重建有利于表皮干細胞增殖分化的生理環(huán)境,雖然治療早期表皮的生長相對處于劣勢,實際上,表皮的生長仍相當(dāng)活躍。本文結(jié)果表明,肉芽樣組織中的確有K19表達陽性細胞,至創(chuàng)面愈合早期,再生表皮的中部,即位于基底膜與顆粒層之間有大量的K19表達陽性細胞。鑒于此,作者采用了皮膚針?biāo)幬飳?dǎo)入加彈力壓迫等綜合治療,有效抑制疤痕的過度增生,表皮的生長就由劣勢轉(zhuǎn)為優(yōu)勢,最后,疤痕逐漸變成平軟而富有彈性的組織。近年來,成體干細胞的研究獲得了許多進展。到目前為止,不僅在骨髓、血液、神經(jīng)、皮膚和肝臟等許多組織中發(fā)現(xiàn)了成體干細胞,而且在肉芽組織中發(fā)現(xiàn)了可以分化成脂肪、軟骨、骨的成體干細胞-間充質(zhì)干細胞。最近,ZukPA等人在人類脂肪組織中成功分離和鑒定了類似間充質(zhì)干細胞的多能干細胞。同時,各種各樣的動物相繼克隆成功,也初步顯示已分化成熟的有核細胞仍具有全能性。這些研究提示了Ⅲ度燒傷創(chuàng)面很有可能獲得原位再生修復(fù),但有關(guān)K19在人體Ⅲ度燒傷創(chuàng)面原位再生修復(fù)過程中不同時期的表達特征以及K19與原位再生修復(fù)的關(guān)系等尚未見詳細報道。本文應(yīng)用過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素SP)免疫組化法,以小鼠抗人K19型單克隆抗體檢測Ⅲ度燒傷創(chuàng)面原位再生修復(fù)的不同時期、不同組織K19表達的特征;另外,選擇既往我院手術(shù)治療的6例外院診治3個月以上未愈的慢性