干擾素對(duì)成纖維細(xì)胞的影響

干擾素對(duì)成纖維細(xì)胞的影響

成纖維細(xì)胞是傷口愈合過(guò)程中最重要的修復(fù)細(xì)胞，其中一些轉(zhuǎn)化為肌肉細(xì)胞（mfb），這會(huì)導(dǎo)致傷口收縮。創(chuàng)傷愈合后,成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞逐漸凋亡消失。在病理狀態(tài)下,肌成纖維細(xì)胞持續(xù)存在,成纖維細(xì)胞行為異常,過(guò)度產(chǎn)生膠原等細(xì)胞外基質(zhì)并沉積,形成增生性瘢痕。研究表明免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的行為,而γ干擾素(IFNγ)是其中比較肯定的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。我們選擇瘢痕增生好發(fā)患者的供皮區(qū)進(jìn)行研究,藉以了解IFNγ在人體內(nèi)創(chuàng)面上對(duì)成纖維細(xì)胞合成膠原、分化為肌成纖維細(xì)胞等生物學(xué)作用的影響,為IFNγ應(yīng)用于臨床防治瘢痕增生提供理論依據(jù)。皮膚組織病理學(xué)檢測(cè)一、對(duì)象1.對(duì)象選擇:隨機(jī)抽取1999年9月~2000年4月我院整復(fù)外科病房燒傷后患者15例,其中男10例,女5例,年齡25~69歲,燒傷后1~10年?；颊呒韧┢^(qū)均有增生性瘢痕形成,術(shù)前健康狀況良好,血常規(guī)、肝腎功能等實(shí)驗(yàn)室檢查正常。2.實(shí)驗(yàn)分組:采用自身對(duì)照方法,同一患者同時(shí)取皮的兩塊厚度一樣的供皮區(qū)創(chuàng)面,或同一供皮區(qū)創(chuàng)面相距最遠(yuǎn)的兩塊區(qū)域上,各選2cm×2cm大小創(chuàng)面,分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。3.創(chuàng)面處理:將100u單位(相當(dāng)于10μg)的注射用重組人干擾素γ用生理鹽水溶至1ml,注入切取中厚皮片(取皮厚度約0.5mm)的新鮮創(chuàng)面實(shí)驗(yàn)組真皮內(nèi),對(duì)照組不做任何處理,常規(guī)包扎。4.術(shù)后處理:觀察患者是否有發(fā)熱等副作用。術(shù)后第6天供皮區(qū)第1次換藥,按常規(guī)方法,以后持續(xù)觀察創(chuàng)面愈合及瘢痕形成情況。5.組織活檢:創(chuàng)面形成后14d,用直徑5mm的角膜環(huán)鉆取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肉芽組織各1塊,保存?zhèn)溆谩?.組織處理:常規(guī)HE染色;免疫組織化學(xué)檢測(cè)(LSAB法):①α-SMA測(cè)定:組織行冰凍切片,0℃丙酮溶液固定15min,3%過(guò)氧化氫孵育5min,蒸餾水沖洗,TBS液浸泡5min,加1∶20正常血清(阻斷劑),室溫孵育20min;擦去多余血清,加1∶100α-SMA抗體(一抗),室溫孵育90min。TBS沖洗,加1∶400生物素化免疫球蛋白(聯(lián)接劑),室溫孵育60min。TBS沖洗,加1∶400過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Streptavidin),室溫孵育60min。TBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水封片。②Ⅰ型和Ⅲ型膠原檢測(cè):組織行石蠟切片,其余方法同前,一抗為1∶20倍稀釋的Ⅰ型或Ⅲ型膠原抗體。7.圖像分析:應(yīng)用KS400型Zeiss圖像分析系統(tǒng),每張免疫組織化號(hào)切片在40倍物鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野,經(jīng)過(guò)圖像輸入、增強(qiáng)、分割、整理、模式識(shí)別后,進(jìn)行圖像測(cè)量。根據(jù)成纖維細(xì)胞細(xì)胞漿有無(wú)DAB染色區(qū)分陽(yáng)性與陰性細(xì)胞,計(jì)算成纖維細(xì)胞α-SMA陽(yáng)性率;根據(jù)DAB染色的灰度面積,計(jì)算Ⅰ型或Ⅲ型膠原表達(dá)率。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)算每張切片3個(gè)視野的陽(yáng)性表達(dá)率均值,作為相應(yīng)組織的陽(yáng)性表達(dá)率,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間用SAS軟件包行配對(duì)t檢驗(yàn)分析,以P<0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1.自然氣調(diào)劑檢查所有患者術(shù)后無(wú)流感樣不適、明顯發(fā)熱等癥狀,血常規(guī)等實(shí)驗(yàn)室檢查無(wú)改變。供皮區(qū)生長(zhǎng)情況均正常,實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面無(wú)愈合延緩的現(xiàn)象。有5例患者在術(shù)后14d時(shí),觀察到實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組創(chuàng)面干潔、平整。2.炎癥細(xì)胞模型在光鏡下觀察HE染色的組織切片,對(duì)照組肉芽組織中膠原纖維排列紊亂,呈漩渦狀,廣泛細(xì)胞浸潤(rùn),包括炎癥細(xì)胞和大量成纖維細(xì)胞,新生毛細(xì)血管較多,呈積極合成征象。實(shí)驗(yàn)組肉芽組織中膠原纖維排列整齊,粗而清晰,呈迂曲狀,基本與表皮平行,成纖維細(xì)胞相對(duì)較少。3.免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果成纖維細(xì)胞比例以α-SMA陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞數(shù)百分比表達(dá),即肌成纖維細(xì)胞占成纖維細(xì)胞的比例,實(shí)驗(yàn)組均值為38.6%±3.8%,對(duì)照組是56.3%(3.6%,t=15.430,P<0.05(圖1)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的t以視野中Ⅰ型膠原陽(yáng)性的面積百分比表達(dá),實(shí)驗(yàn)組是1.39%±1.04%,對(duì)照組是3.50%±2.99%,t=3.070,P<0.05(圖2)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的比較以視野中Ⅲ型膠原陽(yáng)性的面積百分比表達(dá),實(shí)驗(yàn)組是5.31±2.77%,對(duì)照組是7.99±3.07%,t=4.187,P<0.05(圖3)。治療增肌肉血流體的治療切取中厚皮片的供皮區(qū)創(chuàng)面,與其它累及網(wǎng)狀真皮的損傷一樣,是增生性瘢痕的好發(fā)部位,嚴(yán)重影響整復(fù)外科原發(fā)疾病的預(yù)后,增加了患者的病痛,目前尚缺乏有效的防治方法。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中,直接針對(duì)中厚皮片的供皮區(qū)創(chuàng)面進(jìn)行研究,應(yīng)用親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面真皮內(nèi)注射IFNγ,可以抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的產(chǎn)生,同時(shí)使特征性表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞比例減小。這與IFNγ體外對(duì)成纖維細(xì)胞的作用相符。IFNγ由活性T淋巴細(xì)胞在炎癥環(huán)境和免疫反應(yīng)中釋放產(chǎn)生,具有抗病毒、抗腫瘤、影響細(xì)胞增殖和分化等多種生物學(xué)效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)中,IFNγ可以抑制成纖維細(xì)胞增殖及向肌成纖維細(xì)胞分化,促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡,通過(guò)下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型原膠原mRNA表達(dá)減少總膠原的合成,同時(shí)在一定程度上促進(jìn)體外成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶,加速膠原的降解。還可以抑制肌成纖維細(xì)胞在體外表達(dá)α-SMA的mRNA及蛋白產(chǎn)物。國(guó)外尚有一些IFNγ初步應(yīng)用于臨床的報(bào)道,在增生性瘢痕內(nèi)注射IFNγ,瘢痕有不同程度的萎縮,質(zhì)地變軟,痛癢等癥狀改善,伴以組織學(xué)上Ⅰ、Ⅲ型膠原減少等趨于正常瘢痕的相應(yīng)改變,α-SMA的表達(dá)明顯下降,提示IFNγ通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞的行為防治瘢痕增生的作用。本實(shí)驗(yàn)更多考慮了IFNγ在體內(nèi)預(yù)防瘢痕增生的作用,因?yàn)閯?chuàng)面環(huán)境及所含的細(xì)胞因子直接影響成纖維細(xì)胞的行為,所以增加了創(chuàng)面愈合環(huán)境中的IFNγ含量,并選取肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的高峰期(創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的第14d)進(jìn)行組織學(xué)研究,進(jìn)一步證實(shí)了IFNγ在人體內(nèi)對(duì)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)影響,即減少其合成膠原和為肌成纖維細(xì)胞。關(guān)于IFNγ用于人體后的副作用,在局部注射至增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的資料中偶見(jiàn)報(bào)道,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、畏寒、肌肉酸痛等流感樣不適,局部皮膚干燥,但并不影響治療效果。本次實(shí)驗(yàn)中患者并無(wú)此類明顯表現(xiàn),可能與劑量大小有關(guān)。肉眼觀察愈合創(chuàng)面,實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有延遲愈合的征象,肯定了安全性、可行性。瘢痕增生給患者帶來(lái)了功能、外觀、心理方面的一系列障礙,長(zhǎng)期以來(lái),人們一直在探索合理的治療方案。單純手術(shù)切除具有高復(fù)發(fā)率,除松解攣縮改善功能外,不予采用;加壓治療難以達(dá)到有效壓力,且療程較長(zhǎng);局部去炎松注射的劑量有限,也有復(fù)發(fā)或萎縮過(guò)度的可能,甚至產(chǎn)生Cushing征候群;放射療法則對(duì)局部和全身都有危害。所以細(xì)胞因子這一領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)無(wú)疑開(kāi)辟了新途徑,但動(dòng)物模型的局限,影響了基礎(chǔ)研究的進(jìn)程,相應(yīng)治療方法進(jìn)入臨床有所遲滯。我們的研究從細(xì)胞水平證明IFNγ在人體內(nèi)抑制纖維化的作用,為IFNγ的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。在其他領(lǐng)域,IFNγ治療肝纖維化、肺纖維化、系統(tǒng)性硬皮病等纖維化疾病都獲得公認(rèn)的效果,使我們看到了治療增