去負荷及再負荷過程pi3kakgsk-3信號途徑對骨骼肌蛋白分解及合成代謝的影響

去負荷及再負荷過程pi3kakgsk-3信號途徑對骨骼肌蛋白分解及合成代謝的影響

隨著人類航天業(yè)的發(fā)展和運動損傷恢復的研究，由于負荷去除，廢用性萎縮越來越受到重視。骨骼肌廢用性萎縮主要由于發(fā)生在肢體固定、疾病、癱瘓等制動去負荷情況下,宇航員在失重條件下癥狀尤其明顯。去負荷導致的廢用性肌萎縮主要體現(xiàn)在骨骼肌形態(tài)、結構、代謝方面:包括肌肉重量和體積減少,肌纖維直徑(以橫截面積計算)變小;收縮蛋白,尤其是肌球蛋白重鏈(myosinheavychain,MHC)的表型發(fā)生變化;分解代謝強于合成代謝。針對去負荷廢用性肌萎縮而設計的恢復方式有多種,加入運動負荷是其中一種重要的方式。本文是以大鼠為研究對象,研究懸吊去負荷后,骨骼肌蛋白分解加強,發(fā)生廢用性肌萎縮的骨骼肌再以不同方式的再負荷,探討PI3K/Akt/GSK-3β信號蛋白表達的變化,這對于了解去負荷廢用性肌萎縮的機理和選擇對抗肌萎縮手段具有重要意義。1材料和方法1.1實驗動物與設備雌性SD大鼠24只,SPF級,8周齡,體重(180~210)g。許可證號:SCXK(京)2002-0001,動物編號:0668277(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。標準飼料分籠飼養(yǎng),自由飲食。室溫(22±2)℃,相對濕度50%~70%,12h黑暗與光照交替。動物實驗經(jīng)由北京實驗動物福利倫理委員會北京體育大學分會批準。大鼠適應性飼養(yǎng)3d后,按體重隨機配對原則分4組:正常對照組(NC,n=6)、尾部懸吊去負荷組TS(n=6)、尾部懸吊去負荷14d+再負荷自由活動14d組NR(n=6)、尾部懸吊去負荷14d+再負荷離心運動14d組ER(n=6)。1.2實驗和指標測試1.2.1去負荷建模及再負荷方案去負荷模型:采用廢用性肌萎縮常用的尾部懸吊模型。TS、NR、ER組大鼠尾部懸吊,軀干與平地成25~30°,前肢著地,籠子為航天醫(yī)學工程研究所特制的模擬失重研究用籠子,動物可在內自由活動和飲食。再負荷方案:解懸吊后,NR組自由活動。ER組離心運動2周,分兩個階段:第1周為緩沖適應期,第2周為低強度離心運動。緩沖適應期:離心運動組安靜休息3d作為緩沖,第4d適應性水平跑15min,跑速為11m/min;第5d下坡跑15min,坡度為5%,跑速為11m/min;第6d下坡跑30min,坡度5%,跑速為11m/min。休息1d后進入第2周低強度有氧離心運動期:每天下坡跑,坡度5%,跑速16m/min,時間1h。離心訓練參照Bedford根據(jù)最大攝氧量對應的強度,運動強度相當于58%左右的最大攝氧量水平。1.2.2測試樣本采集與制備2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(45mg/kg)。NC組TS組實驗14d取材,NR和ER組解懸吊按不同再負荷方式恢復14d取材,取右側腓腸肌投入液氮中暫存,取材完成后轉移至80℃冰箱。腓腸肌總蛋白含量測定:考馬斯亮藍法測定蛋白含量。腓腸肌組織液氮研磨,取200mg腓腸肌研磨成的粉末,以1:5(w/v)比例加入蛋白裂解液RIPA,在冰浴條件下,機械勻漿離心力為13000g,冰浴20min之后,4℃離心15min,提上清,-804℃保存?zhèn)溆?。RIPAbuffer(RadioImmunoPrecipitationAssaybuffer):150mMsodiumchloride,1.0%TritonX-100,1.0%NP-40,1.0%sodiumdeoxycholate,0.1%SDS(sodiumdodecylsulphate),50MmTrispH8.0,1.0mMEDTA,1.0mMPMSF,1.0mMNaF4℃保存。1.2.3指標測試與方法免疫印跡半定量檢測PI3K-p85、Akt、GSK3β和p-GSK3β的蛋白表達水平:按變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)-濕轉-免疫檢測步驟,半定量分析。丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺為29:1,分離膠濃度為10%,堆積膠濃度為4%,電泳儀(瑞典LKB),堆積膠中90V電泳,分離膠150V電泳直至溴酚藍到電泳槽底部。電泳完畢,將具有目的條帶的凝膠進行濕轉,固相膜為PVDF(Millipore),孔徑4.5μm。4℃封閉及孵育一抗:將載有目的蛋白的PVDF膜在TBST(3%BSA、mMTris-HCl、mMNaCl)緩沖液封閉:β-actin(1:2000,鼠單抗)、β-tubulin(1:1000,鼠單抗)、PI3K(1:500,兔多抗)、Akt(1:2000,鼠單抗)、GSK-3β(1:2000,鼠單抗)、p-GSK-3β(1:2000,兔多抗)(SantaCruz)。一抗4℃過夜孵育后,TBST搖床洗膜3次,每次5min。二抗室溫孵育1h,羊抗小鼠IgG-HRP(1:8000)、羊抗兔IgG-HRP(1:8000),TBST洗膜3次,每次5min。暗室曝光,ECL化學發(fā)光液孵育印跡膜,柯達膠片壓片,顯影定影,凝膠系統(tǒng)拍照后ImageJ圖像處理分析蛋白條帶積分光密度。1.2.4數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計學處理收集的數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,結果用平均值±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩組間的比較用獨立樣本t檢驗,多組間的比較用方差分析。2結果2.1ts組總蛋白含量的變化去負荷14d后,大鼠腓腸肌的總蛋白含量顯著下降。如表1所示,與NC組相比,TS組總蛋白含量顯著性下降,p<0.05;再負荷14d,以自由活動及低強度有氧離心運動兩種處理方式進行再負荷比較,NR組及ER組腓腸肌總蛋白含量上升,ER組比NR組含量略高,但兩個組之間沒有顯著性差異。2.2pi3k蛋白表達PI3K/Akt白表達水平的變化去負荷14d,TS組PI3K-p85蛋白表達略有升高,PKB略有下降,與NC組相比沒有顯著性差異;在不同條件下再負荷14d,與NR組相比,ER組PI3K蛋白表達顯著高于NR組,P<0.05;ER組Akt也高于NR組,但兩組之間沒有顯著性差異。2.3再負荷對er組gsk-3蛋白表達的影響P-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達水平的變化去負荷14d,P-GSK-3β和βGSK-3β蛋白表達與對照組沒有顯著性差異。在不同條件下再負荷14d,與NC組相比,NR組的P-GSK-3β表達減少,但沒有顯著性差異;而GSK-3β蛋白增加,也沒有顯著性差異。ER組的P-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達與NR組的趨勢相似,其中ER組的P-GSK3β與NC組相比,有顯著性差異,P<0.05;而GSK-3β則顯著增加P<0.05。NR組與ER組之間P-GSK-3β和βGSK-3β蛋白表達略有差別,但兩者之間沒有顯著性差異。3負荷抗阻訓練去負荷導致的骨骼肌廢用性萎縮是失重引起的不良影響之一,不僅發(fā)展速度快(5~7d),且嚴重影響肌肉正常功能。由于去負荷或微重力作用下,肌肉受載荷刺激減少,肌肉質量丟失,肌力下降,收縮特性以及代謝特征都發(fā)生變化。去負荷的主要結果使蛋白質合成作用減弱,分解作用加強。這可能在懸吊期間,去負荷或微重力作用激發(fā)了細胞凋亡信號,從而導致了廢用性肌萎縮有關。如Parco等2005年研究顯示,大鼠懸吊14d后,腓腸肌濕重明顯減輕,下降30%;腓腸肌濕重/體重比下降11%;凋亡的DNA片段含量增加119%;BaxmRNA增加73%,且Bax和Bcl-2蛋白水平明顯增加,這充分表明,在懸吊期間,去負荷激發(fā)了與骨骼肌蛋白質降解信號,使蛋白質分解作用增加而合成代謝作用減弱,同時伴有肌細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象,導致廢用性肌萎縮的發(fā)生。本研究顯示,懸吊去負荷14d后,去負荷組大鼠腓腸肌的總蛋白含量顯著性下降(P<0.05)。對于失重狀態(tài)下宇航員的研究也證實,去負荷能使骨骼肌代謝加強,肌肉質量下降,Trappe等(2009)研究表明,宇航員經(jīng)過6個月的國際空間站太空飛行,腓腸肌質量丟失10%±2%,比目魚肌丟失15%±2%(P<0.05)。去負荷使肌肉蛋白合成率下降,分解率增加,同時伴有不同程度的肌細胞凋亡,最終導致骨骼肌發(fā)生費用性萎縮。去負荷使肌肉蛋白合成率下降,分解率增加。通過對抗廢用性肌萎縮措施,通過抗阻訓練誘導骨骼肌纖維產(chǎn)生肥大效應,激發(fā)骨骼肌蛋白合成信號,增強合成代謝作用,可能有效治療或減慢骨骼肌萎縮。Adams等(2007)通過電刺激方法,結合等長收縮、向心收縮及離心收縮來防止廢用性肌萎縮。這種復合式抗阻練習能有效刺激訓練腿一側的骨骼肌合成代謝增強,維持肌肉質量及肌纖維含量。經(jīng)過負荷抗阻訓練一側的肌肉,合成代謝或肌原性標志物的總RNA和mRNA數(shù)量增加,翻譯水平提高,如:IGF-1、myoferlin和procollagenIII-α-1;而參與調節(jié)骨骼肌大小的負調節(jié)的myostatin減少。同時,負荷抗阻模型還能刺激合成代謝信號活動的媒介物的活性,如p70S6激酶。這些研究表明,動靜結合的負荷抗阻訓練能有效刺激合成代謝/生肌調節(jié)機制,對抗早期的廢用性萎縮。骨骼肌生長涉及多種不同過程,包括蛋白合成增殖分化、肌衛(wèi)星融合以及肌肉特異性基因表達。目前在體育科研中研究運動對增強骨骼肌蛋白合成率的信號途徑只要集中在IGF-I/PI3K/Akt/mTOR以及IGF-I/PI3K/Akt/GSK-3β信號途徑,并且已經(jīng)證明這個途徑對維持肌肉體積大小、刺激肌肉肥大及抑制肌肉萎縮方面有重要作用。在研究IGF-I/PI3K/Akt途徑對骨骼肌纖維生長的作用表明,通過在體電轉染組成型活性的Akt-1或Akt-2一周,Akt-1過表達使轉染肌纖維橫截面積增大170%,Akt-2使肌纖維增大100%(P<0.001)。Akt-1或Akt-2的Ser473磷酸化作用增加2.5倍。此外,研究顯示,還可以通過抑制GSK-3β來防止和治療肌萎縮。用IGF-I抑制蛋白降解,至少部分地通過PI3K/Akt介導滅活GSK-3β活性有關。IGF-I能提高GSK-3磷酸化作用減弱GSK-3β激酶活性。特異性抑制PI3K,也能減弱IGF-I誘導-的GSK-3磷酸化作用。萎縮復原的骨骼肌中,滅活的GSK-3β與肌核生長以及生肌細胞分化相關聯(lián)。這些研究說明,對抗去負荷廢用性肌萎縮,可以通過激發(fā)細胞內IGF-I/Akt/mTOR以及IGF-I/Akt/GSK-3β信號途徑協(xié)調作用來完成。本研究以14d去負荷懸吊為模型,以自由活動及低強度有氧訓練比較對腓腸肌蛋白合成的影響,假設低強度有氧訓練可能有效促進廢用性肌萎縮恢復,增加骨骼肌蛋白合成率。研究結果顯示,自然再負荷14d,以自由活動及低強度有氧離心運動兩種處理方式進行再負荷比較,兩種方式都能增加腓腸肌蛋白質含量,其中低強度有氧訓練組比自由活動組總蛋白含量高,但兩組之間沒有顯著性差異。這說明再負荷的重力作用能刺激腓腸肌的蛋白質合成,但低強度有氧運動的方式比自由活動的對刺激蛋白質合成的作用優(yōu)勢不是十分明顯。此外,在去負荷條件下,PI3K、Akt、GSK-3β和P-GSK-3β與正常對照組沒有明顯變化;而在再負荷條件下,PI3K、Akt、GSK-3β和P-GSK-3β出現(xiàn)明顯變化,其中低強度離心運動組與自由活動組相比較,PI3K顯著性增多;Akt也增多,但沒有顯著性差異;P-GSK-3β顯著性減少;GSK-3β顯著性增多,說明GSK-3β活性減弱。這些實驗結果表明,對去負荷導致的廢用性萎縮模型的腓腸肌進行再負荷恢復過程中激發(fā)了PI3K/Akt/GSK-3β信號,腓腸肌蛋白合成增加,這也說明PI3K/Akt/GSK-3β信號可能參與了骨骼肌蛋白的合成作用。許多研究表明GSK-3β在心肌和骨骼肌生長中作為負調節(jié)因子。在萎縮復原的骨骼肌中,滅活的GSK-3β與肌核生長以及生肌細胞分化相關聯(lián)。細胞培養(yǎng)的研究結果顯示,IGF-I抑制蛋白降解至少部分地通過PI3K/Akt介導滅活GSK-3β。通過肌原細胞修飾的小鼠的胚胎成纖維細胞C2C12肌原細胞分化過程研究顯示,缺少GSK-3β蛋白及活性導致加強肌管形成以及骨骼肌特異基因表達。抑制GSK-3β能恢復生肌細胞的分化。在給予IGF-I或LiCl抑制GSK-3活性,能刺激生肌細胞生長,增加肌管形成,肌酸激酶活性,troponinI促進子轉活,并且上調MyoD、Myf-5、Myogenin等的成肌甚至因子的蛋白表達。此外,研究還證實,在骨骼肌中,胰島素以及運動都能減少GSK-3β活性。運動刺激PI3K/Akt/GSK-3β信號影