蛋白質(zhì)對宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物數(shù)量的影響

蛋白質(zhì)對宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物數(shù)量的影響

蛋白質(zhì)飼料是反芻動物飼料中最重要的氮來源。然而，中國的蛋白質(zhì)資源非常稀缺。預計2020年中國的蛋白質(zhì)供應不足0.48億噸。高效合理地利用蛋白質(zhì)飼料資源可在一定程度上緩解蛋白質(zhì)飼料資源緊張的局面。反芻動物是主要的粗飼料利用者,其飼糧主要依靠瘤胃微生物來消化,瘤胃中存在的細菌、真菌及原蟲均具有分解利用纖維物質(zhì)的能力,在纖維物質(zhì)的分解利用過程中細菌和真菌發(fā)揮了80%的作用,原蟲起平衡控制作用。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是3種主要的瘤胃纖維素分解菌。調(diào)控瘤胃微生物是提高飼料的利用率、緩解蛋白質(zhì)飼料資源短缺、提高經(jīng)濟效益的有效途徑之一。而前人對瘤胃微生物的研究中,在飼糧方面主要是針對精粗比和粗飼料不同的研究,對精料中蛋白質(zhì)飼料不同對瘤胃纖維降解微生物的影響方面的研究較少。瘤胃微生物在瘤胃內(nèi)主要是存在于瘤胃液、附著于瘤胃內(nèi)壁上和黏附于飼料顆粒上。大量研究表明,瘤胃固相微生物數(shù)量高于瘤胃液,是瘤胃中主要的功能微生物。因此,研究不同蛋白質(zhì)飼料對宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物的影響顯得非常重要。豆粕、菜籽粕和棉籽粕是我國經(jīng)常使用的植物性蛋白質(zhì)飼料。本試驗選用這3種蛋白質(zhì)飼料等量替代基礎(chǔ)飼糧中15%精料來飼喂宣漢黃牛,研究瘤胃固相黏附纖維降解微生物數(shù)量的變化,旨在為更好地調(diào)控瘤胃微生物,提高飼料的利用率提供一定的參考。1材料和方法1.1dna分子質(zhì)量菜籽粕、棉籽粕、豆粕及其他飼料原料均來自四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所試驗基地;TIANampStoolDNAKit、RNaseA(100mg/mL)、DNA分子質(zhì)量標準、6×DNA上樣緩沖液、DNase/RNase-freeddH2O、SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)均購自TIANGEN(北京)公司。主要設備有熒光定量PCR儀(CFX96TM,美國Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene)、核酸蛋白檢測儀(DU-800,美國Beckman)。1.2基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平選用四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所試驗基地4頭體況良好,裝有永久性瘤胃瘺管的4歲去勢宣漢黃牛[平均體重(455.45±18.93)kg]。采用4×4的拉丁方設計,共4期,每期10d(預飼7d,采樣3d)?；A(chǔ)飼糧參考我國《肉牛飼養(yǎng)標準》(NY/T815—2004)設計,1.3倍維持需要,精粗比為4∶6,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1,基礎(chǔ)組飼喂基礎(chǔ)飼糧。試驗組分別飼喂以豆粕(豆粕組)、棉籽粕(棉籽粕組)和菜籽粕(菜籽粕組)等量替換基礎(chǔ)飼糧中的精料(替換比例為基礎(chǔ)飼糧的15%)的試驗飼糧,其營養(yǎng)水平見表2?；A(chǔ)組、豆粕組、菜籽粕組和棉籽粕組每頭牛飼喂量分別為7.35、6.93、7.19和6.99kg/d(干物質(zhì)基礎(chǔ)),平均分成2次定時(07:00和17:00)定量飼喂,拴系飼養(yǎng),自由飲水。參考張麗英的方法測定飼糧干物質(zhì)(DM)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量。按照VanSoest等的方法測定飼糧中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)含量。采用高錳酸鉀法間接測定飼糧鈣(Ca)含量,采用鉬酸鹽法測定飼糧總磷(TP)含量。1.3單次攝食時間,第3天12:243d采樣時間分別為第1天08:00和14:00,第2天10:00和16:00,第3天12:00,即采食后1、3、5、7和9h。在每頭牛的瘤胃內(nèi)分別取上、下、左、右、中5個位置的瘤胃內(nèi)容物約200g,并用4層紗布過濾分離出固相樣品,裝入無菌封口袋中,樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩?.4指標和方法的測量1.4.1總dna的提取將瘤胃固相樣品4℃解凍后,參考Kang等和Laure等的方法洗脫固相黏附微生物。取1g樣品于滅菌10mL離心管中,加入5mL磷酸鹽緩沖液懸浮,混勻30s,350×g室溫離心15min,取上清于一新的滅菌離心管。再向殘渣部分加入4mL厭氧條件下制備的0.15%(V/V)吐溫80,充分混勻后在冰上放置2.5h,350×g室溫離心15min,取上清于前一離心管,10000×g4℃離心20min,去上清留沉淀。然后使用TIANampStoolDNAKit試劑盒提取微生物總DNA。用核酸蛋白檢測儀測定提取的總DNA的濃度及OD260nm/OD280nm。于-20℃保存。1.4.2熒光強度的檢測采用熒光定量PCR技術(shù)測定各組飼喂后1、3、5、7和9h宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物相對于瘤胃總菌的數(shù)量。引物序列及參數(shù)見表3,引物由上海華大生物技術(shù)有限公司合成。反應體系為15μL:2×SuperRealPreMixPlus7.5μL,上、下游引物(10μmol/L)各0.45μL,總DNA溶液0.6μL,RNase-freeddH2O6μL。擴增條件為:95℃預變性15min,95℃變性10s,相應的退火溫度30s,共40個循環(huán)。自動檢測熒光強度。擴增反應的特異性通過對PCR終產(chǎn)物制作熔解曲線來確定,方法為:從65℃升溫到95℃,每隔5s升高0.5℃,儀器自動繪制熔解曲線。熒光定量PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.2籽粕組真菌數(shù)量變化由表4可知,隨著采食時間的延長,基礎(chǔ)組和菜籽粕組真菌數(shù)量變化趨勢相似,均呈現(xiàn)降低-升高-降低-升高的趨勢。各組原蟲、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量的變化趨勢各不相同。2.2.1不同放養(yǎng)期對大豆種植真菌數(shù)量的影響,主要有3個展基礎(chǔ)組、菜籽粕組、豆粕組和棉籽粕組的真菌數(shù)量分別在采食后9、5、5和7h時達到最大值。除采食后5h外其余各時間點組間差異顯著(P<0.05)。其中,采食后1h,豆粕組真菌的數(shù)量顯著低于其余各組(P<0.05)。采食后3和9h,3個試驗組均顯著低于基礎(chǔ)組(P<0.05)。采食后7h,棉籽粕組顯著高于菜籽粕組(P<0.05),極顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.01),菜籽粕組顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。從各組平均值來看,基礎(chǔ)組和棉籽粕組均顯著高于菜籽粕組和豆粕組(P<0.05)。2.2.2各組日攝食前后棉籽粕和菜籽粕組間的匹配比例基礎(chǔ)組、菜籽粕組、豆粕組和棉籽粕組的原蟲數(shù)量分別在采食后3、3、7和9h時達到最大值。采食后1和3h,菜籽粕組原蟲的數(shù)量顯著或極顯著高于其余3組(P<0.05或P<0.01)。采食后5和7h,各試驗組都顯著高于基礎(chǔ)組(P<0.05)。采食后9h,棉籽粕組顯著高于菜籽粕組(P<0.05),極顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.01),菜籽粕組顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。從各組平均值來看,菜籽粕組原蟲數(shù)量顯著高于豆粕組和棉籽粕組(P<0.05)、極顯著高于基礎(chǔ)組(P<0.01)。2.2.3組小鼠網(wǎng)口最大ph的比較基礎(chǔ)組和棉籽粕組的白色瘤胃球菌數(shù)量在采食后7h時達到最大值,菜籽粕組和豆粕組在采食后5h時達到最大值。采食后1h,菜籽粕組白色瘤胃球菌的數(shù)量顯著高于其余3組(P<0.05)。采食后3h,棉籽粕組顯著高于菜籽粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。采食后5h,豆粕組顯著高于菜籽粕組和棉籽粕組(P<0.05)。采食后7h,棉籽粕組顯著高于菜籽粕組(P<0.05),極顯著高于豆粕組(P<0.01)。采食后9h,棉籽粕組顯著高于其余3組(P<0.05)。從各組平均值來看,各組間差異不顯著(P>0.05),從數(shù)值上排序為棉籽粕組>基礎(chǔ)組>豆粕組>菜籽粕組。2.2.4菜籽粕和豆?jié){對3h組采后3h的影響基礎(chǔ)組和菜籽粕組的黃色瘤胃球菌數(shù)量在采食后9h時達到最大值,豆粕組和棉籽粕組在采食后7h時達到最大值。除采食后3h時菜籽粕組和豆粕組差異不顯著(P>0.05)外,3個試驗組其余4個時間點和平均值都是菜籽粕組顯著或極顯著高于豆粕組和棉籽粕組(P<0.05或P<0.01)。除采食后1和3h時,豆粕組顯著高于棉籽粕組(P<0.05)外,其余3個時間點和平均值豆粕組和棉籽粕組差異不顯著(P>0.05)。2.2.5產(chǎn)惡意桿菌數(shù)量的比較基礎(chǔ)組、菜籽粕組、豆粕組和棉籽粕組的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量分別在采食后3、9、7和7h達到最大值。采食后1h,菜籽粕組和豆粕組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量顯著高于棉籽粕組和基礎(chǔ)組(P<0.05)。采食后3和7h,3個試驗組間差異均不顯著(P>0.05)。采食后5h,菜籽粕組顯著高于豆粕組(P<0.05)。采食后9h,菜籽粕組顯著高于豆粕組和棉籽粕組(P<0.05)。從各組平均值來看,菜籽粕組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著高于豆粕組和棉籽粕組(P<0.05)。3討論3.1干酵母粉對瘤胃真菌數(shù)量的影響瘤胃真菌在纖維物質(zhì)降解過程中起著積極的作用。在正常飼養(yǎng)條件下,瘤胃微生物數(shù)量在109~1010個/mL時,真菌游動孢子數(shù)量在103~105個/mL之間,本試驗得到的真菌數(shù)量較總菌數(shù)量低4個數(shù)量級左右,與之一致。本試驗結(jié)果表明,不同蛋白質(zhì)飼料顯著影響瘤胃固相黏附真菌的數(shù)量,其中棉籽粕組真菌的數(shù)量平均值顯著高于菜籽粕組和豆粕組。王海榮對綿羊的研究得出,不同氮源飼糧對瘤胃真菌濃度和數(shù)量影響顯著,棉籽粕組瘤胃真菌數(shù)量顯著高于豆粕組;王貞貞在綿羊上的研究得到,棉籽粕組瘤胃真菌數(shù)量最多,豆粕組數(shù)量最少。以上研究均與本試驗結(jié)果一致或相似。瘤胃厭氧真菌的種群密度與飼糧中的纖維物質(zhì)含量有很大關(guān)系,纖維物質(zhì)含量豐富的飼糧因在瘤胃中有較長的滯留時間,通常導致瘤胃中厭氧真菌的數(shù)量較高,本試驗所用的4種飼糧,棉籽粕組和基礎(chǔ)組的纖維含量略高于豆粕組和菜籽粕組,這與各組真菌數(shù)量的差異結(jié)果一致。3.2蛋白質(zhì)飼料對原蟲區(qū)系的影響一般將原蟲分為鞭毛蟲和纖毛蟲,瘤胃中個體最大,數(shù)量最多,最重要的原蟲是纖毛蟲。大多數(shù)纖毛蟲具有很強的纖維降解活性,去原蟲會降低纖維素的消化率。已有研究表明,原蟲對不同的蛋白質(zhì)底物的作用不同,飼糧結(jié)構(gòu)在很大程度上影響反芻動物瘤胃中纖毛蟲的組成和數(shù)量。王夢芝等運用遺傳指紋圖譜研究不同的蛋白質(zhì)飼料對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵和其群體結(jié)構(gòu)的影響,表明原蟲區(qū)系類群結(jié)構(gòu)在各組間明顯不同;羅成的研究也得出,不同蛋白質(zhì)組成的飼糧對陜北白絨山羊瘤胃原蟲蛋白質(zhì)濃度有顯著的影響。本試驗結(jié)果說明,不同蛋白質(zhì)飼料顯著影響瘤胃固相黏附原蟲的數(shù)量,前文提及的研究結(jié)果與本試驗的結(jié)果一致。菜籽粕組原蟲數(shù)量平均值顯著高于豆粕組和棉籽粕組,可能是因為纖毛蟲降解可溶性蛋白質(zhì),分解不溶性的蛋白質(zhì)顆粒能力較強,本課題組之前的研究就表明,菜籽粕的不可利用蛋白質(zhì)的含量極顯著地高于豆粕和棉籽粕。正常飼喂條件下,真菌和原蟲在瘤胃共存,它們在纖維物質(zhì)降解中起重要作用,但他們之間存在著捕食與被捕食的關(guān)系,原蟲攝取了真菌的假根和孢子囊,原蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的利用導致真菌數(shù)量減少,而且原蟲的酶可以降解真菌細胞壁,這種方式對真菌的生長有負面影響。本試驗棉籽粕組和菜籽粕組在原蟲和真菌的數(shù)量上剛好相反,或許正是這個原因造成的。3.3產(chǎn)浮酶菌株的數(shù)量反芻動物是粗飼料的主要利用者,細胞壁降解的80%由瘤胃中細菌和真菌完成。細菌由于其在數(shù)量上的絕對優(yōu)勢,在纖維物質(zhì)分解過程中發(fā)揮了特別重要的作用。瘤胃中的纖維素分解菌主要包括白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌。本試驗結(jié)果表明,3種纖維素分解菌中,各組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量最高,這與前人的研究結(jié)果一致,說明產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌也是宣漢黃牛瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢纖維素分解菌。棉籽粕組白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量均高于豆粕組,這與王海榮在綿羊上研究得到的結(jié)果一致。豆粕組和菜籽粕組白色瘤胃球菌的數(shù)量均高于黃色瘤胃球菌的數(shù)量,可能是因為白色瘤胃球菌產(chǎn)生的細菌素抑制了黃色瘤胃球菌的生長。菜籽粕組白色瘤胃球菌的數(shù)量在各試驗組間最低,棉籽粕組最高,但是菜籽粕組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量最高,顯著高于豆粕組和棉籽粕組,這可能是因為當產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌與瘤胃球菌同時存在時,產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量明顯受到抑制。當以纖維素為碳源時,黃色瘤胃球菌與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌存在著競爭關(guān)系,底物不同會影響到它們的競爭狀態(tài)。本試驗豆粕組黃色瘤胃球菌的數(shù)量顯著低于棉籽粕組,但是其產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量高于棉籽粕組,可能正是因為底物的不同導致競爭狀態(tài)的差異。4結(jié)論不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃固相黏附纖維降解微生物的數(shù)量有顯著影響,以菜籽粕對宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物的促進效應最好。1.5閾值循環(huán)循環(huán)根據(jù)Chen等的方法將微生物數(shù)量表示為相對于總菌16SrDNA的百分比,公式如下:式中:Ct為閾值循環(huán)。試驗結(jié)果用Excel