三價(jià)鋁離子-羥基化碳點(diǎn)復(fù)合熒光探針的構(gòu)建及生物成像

三價(jià)鋁離子-羥基化碳點(diǎn)復(fù)合熒光探針的構(gòu)建及生物成像

碳點(diǎn)（cds）作為一種新型的熒光碳納米材料，近年來(lái)引起了越來(lái)越多的研究人員的關(guān)注。它不僅具有優(yōu)良的光學(xué)性能和小尺寸特性,而且還具有良好的生物相容性與極低的生物毒性。近年來(lái),半導(dǎo)體熒光量子點(diǎn)作為熒光納米探針在生物、醫(yī)療等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,然而量子點(diǎn)中的重金屬離子對(duì)生物和環(huán)境均具有很強(qiáng)的毒性,所以其應(yīng)用受到了一定的限制。因此,碳點(diǎn)可有望替代量子點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用到生物成像及檢測(cè)等領(lǐng)域。最近,我們報(bào)道了一種合成表面羥基化熒光碳點(diǎn)的新方法。所得碳點(diǎn)具有較好的熒光性能、強(qiáng)的水溶性以及低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)。由于碳點(diǎn)表面帶有大量羥基,所以氫氧化物溶度積較小的金屬離子(如Hg2+,Cr3+,Al3+,Fe3+)非常容易與其發(fā)生作用,使得碳點(diǎn)發(fā)生聚集導(dǎo)致其熒光猝滅,基于此我們已經(jīng)研究了Cr3+對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅作用并用于Cr3+的定量檢測(cè)。我們也制備了羧基化碳點(diǎn),并利用其羧基與金屬離子的配位特性構(gòu)建了三價(jià)鋁離子(Al3+)-CDs復(fù)合熒光探針,進(jìn)一步利用氟離子與羧基對(duì)金屬鋁離子的競(jìng)爭(zhēng)特性建立了環(huán)境中氟離子的定量檢測(cè)方法。鋁作為人體所需的微量元素,其含量多少與人的生存和健康息息相關(guān)。過(guò)去人們?cè)`認(rèn)為鋁對(duì)人體無(wú)毒害作用,但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),人體內(nèi)過(guò)量的鋁對(duì)神經(jīng)有毒副作用,甚至?xí)?dǎo)致老年癡呆?？紤]到碳點(diǎn)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景,本文在前文的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了Al3+與羥基化碳點(diǎn)的相互作用,并與Cr3+和Fe3+與碳點(diǎn)的相互作用進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明,低濃度的Al3+能猝滅碳點(diǎn)的熒光;隨著Al3+濃度逐漸增大,被猝滅了的碳點(diǎn)的熒光又逐漸恢復(fù),而Cr3+和Fe3+二者只對(duì)碳點(diǎn)的熒光有猝滅作用,而無(wú)熒光恢復(fù)現(xiàn)象。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器蠟燭購(gòu)于西南大學(xué)教育超市;氫氧化鈉(99%)、鹽酸(37%)均購(gòu)于重慶川東化學(xué)試劑廠;三氯化鐵(重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司);硫酸鋁(成都金山化學(xué)試劑有限公司);三氯化鉻(成都化學(xué)試劑廠);Tris-HCl緩沖溶液用于調(diào)節(jié)碳點(diǎn)與金屬離子相互作用時(shí)的酸度;碳點(diǎn)儲(chǔ)備液(196mg/L)存于4℃冰箱中;實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純,所用溶液均由二次去離子水(18.2MΩ·cm)配制。聚四氟乙烯反應(yīng)釜(100mL,濟(jì)南恒化科技有限公司)與電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶航亞試驗(yàn)儀器有限公司)用于碳點(diǎn)的合成;F-2500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)用于熒光的測(cè)定;ZetasizerNano(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)用于表征碳點(diǎn)的水合粒徑及表面電荷;pHS-3C型酸度計(jì)(成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司)用于酸度的調(diào)節(jié);QL-9011型漩渦混合器(江蘇林其貝爾儀器制造有限公司)用于溶液的混合。1.2次表面活性劑的制備碳點(diǎn)的合成與純化:碳點(diǎn)按照我們先前報(bào)道的方法制備,即首先用潔凈的玻片在燭焰上方收集蠟燭灰,取約25mg蠟燭灰與40gNaOH在100mL燒杯中混勻,再緩慢加入40mL二次水,混勻并超聲30min得到黑色溶液;其次將上述溶液轉(zhuǎn)移到100mL聚四氟乙烯為內(nèi)襯的反應(yīng)釜中并裝好鋼套,于電熱鼓風(fēng)干燥箱中逐漸加熱至200℃并恒溫12h,自然冷卻至室溫;最后將反應(yīng)好的溶液離心除去大顆粒的未反應(yīng)物,用37%的鹽酸調(diào)溶液至中性,再用0.22μm的濾膜過(guò)濾,濾液用MWCO3500的透析袋于二次水中透析2d去除氯化鈉。透析后的碳點(diǎn)溶液于真空干燥箱中烘干即得到黃褐色粉末狀碳點(diǎn),稱重并溶于二次水中,即得質(zhì)量濃度的碳點(diǎn)。金屬離子與碳點(diǎn)作用的光譜測(cè)定:在1.5mL離心管中依次加入適量的二次水、Tris-HCl緩沖液(文中未加注明的pH值均為5.38)、適量體積的表面羥基化的碳點(diǎn)(初始濃度196mg/L,終濃度均為39.2mg/L)以及相應(yīng)的金屬離子,漩渦混勻后,室溫反應(yīng)20min,用熒光分光度計(jì)(λex,310nm)進(jìn)行掃描獲得熒光發(fā)射光譜。2結(jié)果與討論2.1al3+濃度對(duì)碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響圖1為Al3+與碳點(diǎn)相互作用的熒光光譜。圖1結(jié)果表明,Al3+與碳點(diǎn)的作用可分為兩個(gè)階段:在Al3+的低濃度范圍內(nèi)(圖1A),隨Al3+濃度的增大,碳點(diǎn)熒光猝滅作用增強(qiáng)并且呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系,最大猝滅效率為85.1%(圖1A內(nèi)嵌圖,F0為空白的最大熒光強(qiáng)度,F為加入一定濃度Al3+后的最大熒光強(qiáng)度),同時(shí)伴隨其最大熒光發(fā)射峰發(fā)生藍(lán)移的現(xiàn)象,Al3+濃度在0.2~2μmol/L范圍內(nèi)可以被定量檢測(cè),線性方程:ΔF=-71.1+433.8c(μmol/L),相關(guān)系數(shù)r=0.9978,檢出限(3σ)為0.026μmol/L;在Al3+的高濃度范圍內(nèi)(圖1B),隨著Al3+濃度的進(jìn)一步增大,被猝滅了的碳點(diǎn)的熒光逐漸恢復(fù),當(dāng)Al3+的濃度為8000μmol/L時(shí),其熒光強(qiáng)度恢復(fù)了83.4%(圖1B內(nèi)嵌圖),同時(shí)伴隨其最大熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移的現(xiàn)象。這與文獻(xiàn)報(bào)道的大粒徑的碳點(diǎn)熒光峰位置相對(duì)小粒徑的碳點(diǎn)熒光峰位置藍(lán)移是一致的,表明碳點(diǎn)具有獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)。在溶液中Al3+很容易水解,因此,溶液的酸度會(huì)影響Al3+的存在形式,進(jìn)而影響其與碳點(diǎn)的作用。實(shí)驗(yàn)采用Tris-HCl控制溶液的酸度,研究酸度對(duì)Al3+與碳點(diǎn)相互作用的影響,結(jié)果如圖2所示。隨著pH值的增大,碳點(diǎn)本身的熒光強(qiáng)度變化不大,當(dāng)有Al3+存在時(shí),碳點(diǎn)的熒光被猝滅,且在pH值3~6范圍內(nèi)猝滅程度保持穩(wěn)定,但當(dāng)pH>6.5時(shí)其猝滅作用明顯減弱。這是因?yàn)殡S著溶液pH值的增大,Al3+發(fā)生了水解作用而形成羥基鋁,減弱了其與碳點(diǎn)之間的作用,所以對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅作用逐漸減弱。實(shí)驗(yàn)選用pH=5.38的Tris-HCl溶液作反應(yīng)介質(zhì)。2.2al3+與金屬離子的氧離子作用通常情況下,金屬離子對(duì)有機(jī)熒光分子或納米熒光材料存在熒光猝滅或增強(qiáng)的現(xiàn)象,同時(shí)金屬離子在一定濃度范圍內(nèi),隨其濃度的增大對(duì)熒光的猝滅或增強(qiáng)越顯著,直到達(dá)到一個(gè)平臺(tái)。然而,對(duì)于同一種金屬離子在低濃度時(shí)對(duì)納米熒光材料的熒光猝滅,而高濃度時(shí)又使其熒光恢復(fù)的現(xiàn)象報(bào)道很少。為了探究Al3+對(duì)碳點(diǎn)熒光先猝滅后恢復(fù)的這一奇特現(xiàn)象的作用機(jī)理,研究了二者相互作用的Zeta電位與DLS特征。圖3為碳點(diǎn)熒光猝滅與恢復(fù)過(guò)程的表面電荷與水合粒徑的變化情況。碳點(diǎn)表面由于部分羥基發(fā)生電離而形成氧負(fù)離子,呈現(xiàn)一定的負(fù)電性,由于斥力作用,使得碳點(diǎn)呈分散狀態(tài),具有較強(qiáng)的熒光。但隨著Al3+的加入,碳點(diǎn)表面負(fù)電荷逐漸減小,碳點(diǎn)逐漸發(fā)生聚集,水合粒徑增大,熒光猝滅。當(dāng)Al3+濃度增加至8μmol/L時(shí),碳點(diǎn)由負(fù)電性轉(zhuǎn)化為正電性,實(shí)驗(yàn)表明,此時(shí)碳點(diǎn)的熒光猝滅程度達(dá)到最大值。繼續(xù)增大Al3+濃度,碳點(diǎn)表面正電荷先增大,又逐漸降低,最后達(dá)到一個(gè)近平臺(tái)狀態(tài),同時(shí),碳點(diǎn)的水合粒徑也逐漸減小,最后基本不變。由圖3結(jié)果可知,Al3+與碳點(diǎn)表面的羥基形成的氧負(fù)離子結(jié)合后,降低了碳點(diǎn)表面的負(fù)電荷,減小了碳點(diǎn)之間的靜電排斥力,拉近了碳點(diǎn)之間距離,導(dǎo)致碳點(diǎn)聚集熒光猝滅;隨著Al3+濃度的繼續(xù)增大,碳點(diǎn)表面的Al3+達(dá)到飽和,從而體系的正電荷也達(dá)到最大值,同時(shí)又由于靜電排斥作用和空間效應(yīng),碳點(diǎn)又得到了一定分散,而使其熒光得到恢復(fù)。由于Cr3+與Fe3+也非常易與羥基發(fā)生結(jié)合,我們也進(jìn)一步研究了不同濃度的這2種金屬離子對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅情況,結(jié)果如圖4所示。與Al3+不同的是,這2種金屬離子對(duì)碳點(diǎn)的熒光只有猝滅作用,并沒(méi)有在高濃度時(shí)出現(xiàn)碳點(diǎn)熒光恢復(fù)的現(xiàn)象。Al3+之所以會(huì)出現(xiàn)不同于另外2種金屬離子的現(xiàn)象,是由于Al3+能形成兩性氫氧化物。當(dāng)不同濃度Al3+與碳點(diǎn)表面的羥基作用時(shí),受Al3+本身濃度大小、碳點(diǎn)表面的羥基以及體系中pH值的影響,鋁離子可能以一羥基、二羥基鋁和偏鋁酸根等多種形式存在,而Cr3+與Fe3+沒(méi)有這樣的兩性性質(zhì),導(dǎo)致它們與碳點(diǎn)的作用不同于Al3+。具體原因,仍需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究證明。3al3+對(duì)碳點(diǎn)熒光的影響研究了Al3+與羥基功能化碳點(diǎn)之間的相互