第11章 微生物細(xì)胞破碎

第二章回顧發(fā)酵液的特性預(yù)處理的目的改善發(fā)酵液過濾特性的方法發(fā)酵液的相對純化影響固液分離的因素過濾（分類、常用過濾器）；離心分離（分類、常見離心分離設(shè)備）切向流過濾下一章第十一章微生物細(xì)胞破碎許多基因工程產(chǎn)品都是胞內(nèi)產(chǎn)物（目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)克隆表達(dá)成為基因工程產(chǎn)物），細(xì)胞破碎是提取胞內(nèi)物質(zhì)的關(guān)鍵步驟，因此，細(xì)胞破碎技術(shù)引起普遍關(guān)注。胡蘿卜軟腐歐文氏菌紫紅諾卡氏菌黑曲霉脆壁克魯維酵母乳酸酵母凝結(jié)芽孢桿菌鏈霉菌屬點青霉釀酒酵母菌表3.1(續(xù))

幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α--干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟肉瘤概述細(xì)胞破碎（cellrupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細(xì)胞破碎主要采用各種機械破碎法和非機械破碎法，或二者的結(jié)合。機械破碎中細(xì)胞所受的機械作用力主要有壓縮力和剪切力?；瘜W(xué)破碎又稱化學(xué)滲透，利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率；或完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓的作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。第一節(jié)細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)表3.2各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成多聚糖（80%—90%）脂類蛋白質(zhì)葡聚糖（30%—40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6%—8%）脂類（8.5%—13.5%）肽聚糖（5%—10%）脂蛋白磷脂脂多糖（1%—4%）蛋白質(zhì)肽聚糖（40%—90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1%—4%）主要組成多層多層多層單層層次100—250100—30010—1320—80壁厚/nm霉菌酵母菌革蘭氏陰性細(xì)菌革蘭氏陽性細(xì)菌微生物一、細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分，結(jié)構(gòu)為機械性強度很大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強度取決于多糖鏈上所存在的肽鍵數(shù)量和其交聯(lián)的程度。交聯(lián)程度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就越致密，破碎的難度也就越大。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較堅固；革蘭氏陰性細(xì)菌的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較疏松。二、酵母菌細(xì)胞壁酵母菌細(xì)胞壁比革蘭氏陽性細(xì)菌要厚，但不及革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁堅韌。酵母菌細(xì)胞壁破碎的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。霉菌細(xì)胞壁霉菌中大多數(shù)的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的。細(xì)胞壁的強度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁要高。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與細(xì)胞破碎破碎細(xì)胞必須克服的主要阻力是連接細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價鍵。細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞壁的厚度和聚合物的交聯(lián)程度是影響破碎難易程度的重要因素。細(xì)胞個體小，球形，壁厚，聚合物交聯(lián)程度高是最難破碎的。微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)取決于遺傳信息、培養(yǎng)的生長環(huán)境和菌齡。霉菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)隨培養(yǎng)過程中機械攪拌作用的強弱而變化。所以，通過改變遺傳密碼或培養(yǎng)的環(huán)境因素可改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞破碎的原則

需通過實驗確定適宜的破碎器和破碎操作條件，獲得最佳的破碎效率。在細(xì)胞內(nèi)存在的許多種物質(zhì)中，選擇性釋放目標(biāo)生化物質(zhì)，而使其他物質(zhì)盡量少地釋放出來，并且盡量降低細(xì)胞的破碎程度，在保證目標(biāo)生化物質(zhì)有較高收率的前提下，使下游加工過程的成本最低。選擇性地釋放目標(biāo)生化物質(zhì)的關(guān)鍵是要根據(jù)目標(biāo)生化物質(zhì)的性質(zhì)和在細(xì)胞內(nèi)存在的位置來選擇適當(dāng)?shù)钠扑榉椒ê筒僮鳁l件。選擇性地釋放目標(biāo)生化物質(zhì)？①僅破壞或破碎存在目標(biāo)生化物質(zhì)的位置周圍：當(dāng)目標(biāo)生化物質(zhì)存在于細(xì)胞膜附近時，可采用較溫和的方法，如酶解法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)-融化法等。當(dāng)目標(biāo)生化物質(zhì)存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時，則需采用強烈的機械破碎法，產(chǎn)物與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法。②選擇性溶解目標(biāo)生化物質(zhì)：當(dāng)目標(biāo)生化物質(zhì)處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時，調(diào)整溶液pH值、離子強度或添加與目標(biāo)生化物質(zhì)具有親和性的試劑如螯合劑、表面活性劑等,使目標(biāo)生化物質(zhì)容易溶解釋放。所選的溶液體系應(yīng)使其他雜質(zhì)不易溶出。第二節(jié)常用破碎方法按其是否使用外加作用力可分為機械法和非機械法兩大類高速濕法珠磨法和高壓勻漿法已經(jīng)在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，酶解法和化學(xué)溶胞法也大量應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎中，超聲破碎法和微波破碎法的實驗室研究開發(fā)相當(dāng)活躍。表3.3細(xì)胞破碎方法分類非機械法

條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活改變細(xì)胞膜的滲透性干燥法破碎率較低，不適合對冷凍敏感的目的產(chǎn)物反復(fù)凍結(jié)－融化凍結(jié)融化法破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用滲透壓劇烈改變滲透壓法具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差改變細(xì)胞膜的滲透性化學(xué)滲透法具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差酶分解作用酶溶法破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適應(yīng)固體剪切作用X-press法對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作液體剪切作用超聲破碎法可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌液體剪切作用高壓勻漿法可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難固體剪切作用珠磨法機械法適應(yīng)性作用機理分類機械破碎機械破碎處理量大、破碎效率高、速度快,主要靠均質(zhì)作用和球磨碾磨作用；操作時，細(xì)胞遭受強大的機械剪切力而被破碎。采用機械法，發(fā)熱是一個主要問題其次，不容易規(guī)模放大。細(xì)胞的機械破碎主要有:珠磨高壓勻漿超聲波破碎X-press法等方法。珠磨法工作原理是：進(jìn)入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑﹤1mm）一起快速研磨或攪拌，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器作用下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。過程中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。珠磨法破碎細(xì)胞分為間歇或連續(xù)操作。珠體的大小應(yīng)以細(xì)胞大小、濃度以及連續(xù)操作時不使珠體帶出作為選擇依據(jù)。珠體的裝量要適中。裝量少時，細(xì)胞不易破碎；裝量大時，能量消耗大，研磨室熱擴散性能降低，引起溫度升高。珠磨法提高細(xì)胞破碎率的措施：延長研磨時間、增加珠體裝量、提高攪拌轉(zhuǎn)速提高操作溫度高破碎率帶來的問題:能量消耗大大增加產(chǎn)生較多的熱能，增大了冷卻控溫的難度；大分子目的產(chǎn)物的失活損失增加；細(xì)胞碎片較小，分離碎片不易，給下一步操作帶來困難。所以，不僅要考慮總收率，而且要兼顧下游過程。珠磨的細(xì)胞破碎效率隨細(xì)胞種類而異，適用于絕大多真菌菌絲和藻類等微生物細(xì)胞的破碎。高壓勻漿法高壓勻漿法的原理是利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破裂，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度可達(dá)幾百米（可達(dá)到450m/s）。這種高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。操作壓力通常為50～70Mpa。影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器的次數(shù)。增大壓力和增加破碎次數(shù)都可以提高破碎率，但壓力增大到一定程度后對勻漿器的磨損較大。高壓勻漿法適用于酵母和細(xì)菌細(xì)胞的破碎，料液細(xì)胞濃度可達(dá)到20%左右。高壓勻漿法不宜采用高壓勻漿法破碎的微生物細(xì)胞有：易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，以及含有包含體的基因工程菌，因為包含體質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥。高壓勻漿器的種類較多：WAB公司的AVPGaulin31MR型，最大操作壓力為24MPa，最大處理量為為100dm3/hBranandluebbe公司SHL40型，最大操作壓力為20-63MPa，最大處理量為為2.6-34m3/h意大利NiroSoavi-系列高壓均質(zhì)機，最大操作壓力為60～150MPa，最大處理量為為20-30m3/h注意事項：高壓勻漿器的操作溫度上升約２－３℃/10MPa，為了保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，需要對料液作冷卻處理。多組破碎操作中需要在級間設(shè)置冷卻裝置可有效防止溫度上升，保護(hù)產(chǎn)物活性。超聲波破碎也是應(yīng)用較多的一種破碎法，通常采用的超聲破碎機在15—25KHz的頻率下操作。機理：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。常用的設(shè)備為電聲超聲波發(fā)生器，它是由發(fā)聲器和換能器組成，發(fā)聲器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機械振動。超聲波振蕩器又可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波破碎優(yōu)點：超聲波破碎很強烈，適用于多數(shù)微生物的破碎。缺點：A、影響因素多，如聲強、聲頻、溫度、時間、離子強度、pH、細(xì)胞類型、振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀；B、超聲產(chǎn)生超氧離子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、產(chǎn)熱大，需控溫；E、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。X-press法（撞擊破碎）原理：細(xì)胞是彈性體，比一般剛性固體粒子難于破碎。將彈性細(xì)胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎難度，撞擊破碎正是基于這樣的原理。操作：X-press法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體（粒徑小于50μm），利用500MPa以上的高壓沖擊（如氮氣，流速約300m/s），使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形引起破碎。X-press法（撞擊破碎）特點：①細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細(xì)胞破碎均勻，可避免反復(fù)受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象；②細(xì)胞破碎程度可通過無級調(diào)節(jié)載氣壓力（流速）控制，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細(xì)胞器（如線粒體、葉綠體等）的回收。③實驗室和工業(yè)規(guī)模均可應(yīng)用，細(xì)胞濃度在10-20%，實驗室規(guī)模的間歇處理能力在50-500mL/h，工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理在10000mL/h以上。撞擊破碎適于微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎。非機械方法

處理條件一般比較溫和，有利于目標(biāo)生化物質(zhì)的高活力釋放回收，缺點：破碎效率較低、產(chǎn)物釋放速度較慢，處理時間較長，多局限于實驗室規(guī)模的小批量應(yīng)用。微生物細(xì)胞常用的非機械破碎法酶溶法化學(xué)滲透法微波破碎滲透壓法反復(fù)凍結(jié)-融化干燥法

等酶溶法利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達(dá)到破壁的目的。分外加酶法和自溶法兩種。外加酶法常用的溶酶有溶菌酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶等，細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物。外加酶法主要用于實驗室規(guī)模，是細(xì)胞工程進(jìn)行原生質(zhì)體融合的常用方法。優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。不足：一是溶酶價格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用，回收溶酶則需增加分離純化溶酶的操作和設(shè)備。二是溶酶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件。三是產(chǎn)物抑制的存在，在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用。酶溶法自溶法溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的。影響自溶的主要因素有溫度、時間、pH、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。微生物細(xì)胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。缺點：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性；自溶后細(xì)胞懸浮液黏度增大，過濾速率下降。因自溶法時間較長，常需要添加少量防腐劑（如甲苯、氯仿等）防止細(xì)菌滋生和污染細(xì)胞壁合成抑制法（青霉素、環(huán)絲氨酸、桿菌肽）化學(xué)滲透法一些化學(xué)試劑可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇的滲透出來。包括：表面活性物質(zhì)EDTA螯合劑有機溶劑變性劑表面活性物質(zhì)可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。主要通過破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層而破膜。天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等，合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；十六烷基三甲基溴化銨（陽離子型）。非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等。從大腸桿菌中提取L-天冬酰胺酶時，常用2％TritonX-100和12.5％K2HPO4溶液處理菌體，可釋放70％以上的酶。EDTA螯合劑處理革蘭氏陰性菌，EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性增強。有機溶劑分解細(xì)胞壁中的類脂。被吸收進(jìn)細(xì)胞壁的類脂中，使胞壁膜溶脹，進(jìn)而使細(xì)胞破碎。有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等變性劑鹽酸胍和脲是常用的變性劑。一般認(rèn)為變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液?；瘜W(xué)滲透法根據(jù)各種試劑的不同作用機理，將幾種試劑合理的搭配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。優(yōu)點：對產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。使較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)。控制條件可以有選擇地釋放出位于細(xì)胞內(nèi)不同部位的產(chǎn)物。細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。缺點：通用性差；時間長，效率低(<50%)；有些化學(xué)試劑有毒性，其后需設(shè)法分離除去。（如表面活性劑存在常會影響鹽析中蛋白質(zhì)的沉淀和疏水層析）微波破碎利用微波場進(jìn)行細(xì)胞破碎的方法。適用于熱穩(wěn)定的生化物質(zhì)，如多糖、低聚糖、生物堿、黃酮、皂甙等成分，但不適用于熱敏性生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酶和多肽等，也不適用于富含淀粉或樹膠的植物。滲透壓法將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液）中，達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破碎。適用于不具有細(xì)胞壁或細(xì)胞壁強度較弱細(xì)胞的破碎。反復(fù)凍結(jié)—融化法機理：一、冷凍過程使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性；二、冷凍時胞內(nèi)水結(jié)晶形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。操作：將細(xì)胞急劇凍結(jié)至－20℃～―15℃，使之凝固，然后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)-融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。缺點：反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)變性，從而影響活性蛋白質(zhì)的回收率。凍結(jié)-融化法適用于比較脆弱的菌體。干燥法有氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等方法。通過干燥使細(xì)胞壁膜的結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。酵母菌常用氣流干燥，一般在25—30℃的氣流中吹干，部分酵母產(chǎn)生自溶，然后用水、緩沖液或其它溶劑抽提。真空干燥適用于細(xì)菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，將冷凍干燥后故菌體在冷凍條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。有機溶劑干燥法，可將菌體懸浮液慢慢倒入10倍體積預(yù)冷至-20℃的丙酮中攪拌，利用丙酮破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)和脂類的結(jié)合，使細(xì)胞脫水，溶解除去膜上部分脂肪，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。如：無錫酶制劑廠的α-淀粉酶、β-淀粉酶、脫支酶等。干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其他活性物質(zhì)變性表3.5機械破碎法與非機械法比較實驗室范圍實驗室、工業(yè)范圍應(yīng)用范圍成本高成本低經(jīng)濟差強通用性不需專用設(shè)備需專用設(shè)備設(shè)備時間長、效率低時間短、效率高時間、效率低(核酸少）高（核酸多）粘度部分全部內(nèi)含物釋放細(xì)胞碎片較大碎片細(xì)小碎片大小溶解局部壁膜切碎細(xì)胞破碎機理非機械法機械法比較項目包含體的破碎

包含體是一種蛋白質(zhì)的聚集(合)體，其中大部分是克隆表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物蛋白，其次還有大腸桿菌菌體蛋白和質(zhì)粒編碼蛋白等。這些目標(biāo)產(chǎn)物在一級結(jié)構(gòu)上是正確的，但在立體結(jié)構(gòu)上卻是錯誤的，因此沒有生物活性。一般地，包含體在透視性相差顯微鏡下為不透明的顆粒，直徑可達(dá)0.1～3.0μm，性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水，僅在變性劑溶液中才能溶解，而且密度較大，有折光性，因此也稱為折光體。包含體形成的原因：①少量蛋白產(chǎn)生時是可溶的.其后積聚的量過多，在細(xì)胞內(nèi)超過其溶解度而沉淀，并隨誘導(dǎo)時間延長，不溶部分增加。但細(xì)胞裂解，并用適當(dāng)溶劑稀釋后，可以轉(zhuǎn)為溶解狀態(tài);②蛋白合成太快，肽鏈來不及形成正常的折疊構(gòu)象，導(dǎo)致分子間疏水基相互作用聚合而不溶，此時即使稀釋也不能溶解，生物活性也受影響;③高表達(dá)的蛋白沒有形成分子內(nèi)正常的二硫鍵連接，這可能是由于肽鍵來不及形成正常的折疊構(gòu)象而導(dǎo)致錯誤的二硫鍵連接，或者是高表達(dá)時細(xì)胞內(nèi)氧化還原等條件不同而生成不同的二硫鍵連接;④蛋白的溶解需要與其他成分結(jié)合或經(jīng)其他成分誘