第一周第一節(jié)

免疫→標(biāo)記技術(shù)測(cè)定袁笑濱醫(yī)附院檢驗(yàn)科病從口入，嚴(yán)格把關(guān)！乙肝五項(xiàng)檢測(cè)HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb高效！快速！禽畜疫??；真菌毒素；激動(dòng)劑類；抗生素；其他：三聚氰胺，蘇丹紅。經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)三大經(jīng)典免疫標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)記技術(shù)的催生1941，Coons，熒光標(biāo)記免疫技術(shù)1956，Berson&Yalow，放射標(biāo)記免疫技術(shù)1966年，Nakane&Pierce，“酶標(biāo)抗體：制備和應(yīng)用于抗原的定位”20世紀(jì)70年代，酶標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)飛速發(fā)展酶免疫技術(shù)原理及特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性底物

E酶標(biāo)抗體EE抗原

是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合的一種免疫檢測(cè)技術(shù)能定性、定位、定量原理及特點(diǎn)原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析

特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒有污染易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法克隆酶供體免疫測(cè)定酶免疫分析技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測(cè)定技術(shù)均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定酶放大免疫測(cè)定技術(shù)液相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位分析

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量酶免疫分析技術(shù)分類主要內(nèi)容第一節(jié)酶標(biāo)記技術(shù)第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)第三節(jié)其他酶免疫測(cè)定技術(shù)

第四節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)

第五節(jié)酶免疫分析技術(shù)案例一、酶標(biāo)記技術(shù)（一）酶和酶作用底物（二）酶標(biāo)記抗體或抗原1.標(biāo)記酶的特點(diǎn)1.自然界分步廣泛，易純化。2.性質(zhì)穩(wěn)定，比活高。3.酶結(jié)合物穩(wěn)定，便于觀察和保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量。5.方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行。6.酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉。2.常用于酶免疫技術(shù)的酶辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase,HPR）堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase)β–半乳糖苷酶（β-Gal）酸性磷酸酶葡萄糖過氧化酶溶菌酶3.酶和酶作用底物RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比-糖蛋白（主酶）-亞鐵血紅素（輔基）-主酶與酶活性無(wú)關(guān)-輔基是酶的活性中心酶活（高比活性）：RZ值與酶活性無(wú)關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要.底物為H2O2：催化物無(wú)色還原型染料生成有色氧化型染料

辣根過氧化物酶3.酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（HRP）的底物

DH2+H2O2D+2H2O

HRPH2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高

供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

3.酶和酶作用底物-2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽。---TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色，測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。---OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。辣根過氧化物酶HRP5-氨基水楊酸5-ASA鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMBABTSHRP常用底物3.酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP）β–半乳糖苷酶（β-Gal）性質(zhì)：磷酸酯水解酶；底物：催化磷酸化合物（單酯、核苷、糖）水解釋放磷酸鹽，同時(shí)生成有色或熒光物質(zhì)；來(lái)源：菌源性AP，腸粘膜AP。底物：β–半乳糖苷，鄰硝基酚β–半乳糖苷，乳糖（測(cè)葡萄糖含量）；來(lái)源：米曲霉。1.3酶和酶作用底物AP的底物β-Gal的底物對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）：經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。

4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）：酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測(cè)量。底物的選擇與使用1.容易獲取。2.性質(zhì)穩(wěn)定。3.對(duì)人的健康沒有危害或危害小。4.與相應(yīng)酶反應(yīng)后產(chǎn)生肉眼可見的明顯變化。5.與相應(yīng)酶反應(yīng)時(shí)間適中（固相酶免疫，10~30min；酶免疫組織化學(xué)，幾分鐘）。6.與相應(yīng)酶反應(yīng)條件不苛刻。底物應(yīng)具備的特點(diǎn)3酶和酶作用底物酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)（nm）

辣根過氧化物酶（HRP）鄰苯二胺

四甲基聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

2,2‘-胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

(ABTS)橘紅色

黃色

棕色

藍(lán)綠色492460449

642

堿性磷酸酯酶（AP）4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

(二)酶標(biāo)記抗原或抗體酶標(biāo)記抗原或抗體酶抗原/抗體通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

酶免疫技術(shù)的核心組成部分酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物1.酶標(biāo)記抗原或抗體條件抗原或抗體制備方法要求抗原要求純度高，抗原性完整?？贵w需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好。標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性。酶標(biāo)記物穩(wěn)定，不形成聚合物。2.酶標(biāo)記抗原或抗體方法過碘酸鈉法（直接法）

原理：氧化酶分子含糖部分生成醛，醛基與IgG分子結(jié)合；特點(diǎn)：標(biāo)記率高，條件不易控制，引起抗體活性下降常用制備方法

戊二醛交聯(lián)法原理：兩個(gè)相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。特點(diǎn)：受酶分子上氨基數(shù)限制，產(chǎn)率低一步法二步法3.酶標(biāo)記抗原或抗體純化及鑒定標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度

常用的純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純3.酶標(biāo)記抗原或抗體純化及鑒定酶標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定1.生物活性測(cè)定：免疫電泳或雙向免疫擴(kuò)散法，出現(xiàn)沉淀線2.酶標(biāo)記抗體效價(jià)和工作濃度測(cè)定ELASA和棋盤滴定法3.酶標(biāo)記率測(cè)定分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)合物中酶和抗體蛋白的含量4.酶標(biāo)記物保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。一、基本原理底物顯色定性或定量的分析包被將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234二、方法類型及反應(yīng)原理（一）檢測(cè)抗原的方法將己知抗體包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.雙抗體夾心法（1）夾心法（sandwichELISA）Ab-Ag-AbES顯色（+）HBsAb/HBeAbhotdogHBsAg/HBeAgHBsAbE/HBeAbE查抗原

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測(cè)抗原適用于檢測(cè)含有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原（1）將已知抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加待檢標(biāo)本,溫育，洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體，洗滌。（4）加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。2．技術(shù)要點(diǎn)

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物（+）1、已知抗體包被載體3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物（無(wú)抗原）3、加酶標(biāo)抗體（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原2.雙位點(diǎn)一步法檢測(cè)抗原

即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)一次溫育和洗滌后，即可加入底物進(jìn)行顯色測(cè)定。

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測(cè)抗原在包被時(shí)使用一種單抗，酶標(biāo)記時(shí)使用一種單抗3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無(wú)抗原）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY（-）YYY洗滌洗滌雙位點(diǎn)一步法測(cè)抗原

如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。注意事項(xiàng)

EE底物固相抗體標(biāo)本（抗原濃度高）酶標(biāo)抗體E3.競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原

酶標(biāo)抗原和待檢抗原對(duì)固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力，二者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合越少，底物顯色反應(yīng)越淺；反之則顯色越深，即底物顯色與待檢標(biāo)本中抗原含量呈反比。

酶標(biāo)抗原

EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）待測(cè)管中加待檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，待檢標(biāo)本中如果含有抗原，則與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)固結(jié)合相抗體，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對(duì)照管中只加酶標(biāo)抗原，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。對(duì)照管中顏色深，待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。技術(shù)要點(diǎn)3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無(wú)抗原）和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原（二）檢測(cè)抗體的方法將已知抗原吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1.間接法

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測(cè)抗體酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白(如抗人IgG），因此該法只需要變換固相抗原，即可用一種酶標(biāo)二抗測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體，具有更廣的通用性4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體（+）YYY3.加酶標(biāo)二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無(wú)抗體）洗滌1.已知抗原包被載體（-）3.加酶標(biāo)二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測(cè)抗體2.雙抗原夾心法

將已知抗原包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。技術(shù)要點(diǎn)E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測(cè)抗體4.加酶作用的底物不顯色（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌YEYYYYEYEYEYE