第四章二維電泳與細胞蛋白質的分離

第四章二維電泳

與細胞蛋白質的分離第一節(jié)概述電泳技術的基本原理電泳：帶電粒子在電場中的定向移動V:泳動速度cm/秒or分d:泳動距離cmt:電泳時間(秒/分)E:電場強度伏特/cm電泳技術的基本原理u:泳動率or泳動度(cm/伏·秒or分)U:電壓常壓(100—500v)高壓(500—10000v)僅需幾分鐘l:支持場的長度(有效長度)電泳技術的基本原理影響泳動率u的因素內因：1.凈電荷2.質點大小3.質點形狀

外因：1.V(U/L)2.緩沖液的pH(pH恒定)3.離子強度[I]最適:0.02-0.24.電滲：液體對固體支持物的相對移動電泳技術的基本原理電泳類型

⑴區(qū)帶電泳紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、粉末電泳、細絲電泳、凝膠電泳凝膠電泳包括：瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠、硅膠凝膠、聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳包括：垂直板、盤狀、等電聚焦、梯度、免疫電泳

⑵自由界面電泳：支持物為溶液，很少用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,Bis)在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate，AP)或核黃素(ribofavin，VB2)的作用下聚合交聯(lián)成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理光聚合：核黃素為催化劑(陽光,日光)，制大孔膠化學聚合：制小孔膠

過硫酸銨(NH4)2S2O3

APS(引發(fā)劑)N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED(加速劑)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理

丙烯酰胺反應方程式：

NH

CH2=CH—CONH2+

CH2=CH—CCH2=CH—C—CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2——CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—CONH2

C=OCH2

NH

NHO

OCONH2C=ONHCH2N,N’-甲叉（亞甲基）雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺NH聚丙烯酰胺凝膠電泳原理三種物理效應⑴樣品濃縮效應

⑵分子篩效應⑶電荷效應聚丙烯酰胺凝膠電泳原理樣品濃縮效應：由凝膠系統(tǒng)的不連續(xù)性產生。

①凝膠孔徑不連續(xù)性②緩沖液離子成份的不連續(xù)性

③pH的不連續(xù)性聚丙烯酰胺凝膠電泳原理①凝膠孔徑不連續(xù)性單體濃度

交聯(lián)度

大孔膠:T=3%C=2.0%小孔膠:T=7%C=2.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳原理①凝膠孔徑不連續(xù)性凝膠網孔大小:聚合鏈長度:由Acr濃度交聯(lián)程度:由Acr與Bis相對比例Bis的濃度低,孔徑大,可在聚合前調節(jié)單體與Bis的濃度比

如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳原理凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質分子量密切相關分子量范圍適用的凝膠濃度/(%)蛋白質<104 20-301-4×104 15-201-5×104-1×10510-151×1055-10>5×1052-5聚丙烯酰胺凝膠電泳原理②緩沖液離子成份的不連續(xù)性

大孔膠pH=6.7先行離子：Cl-存在于凝膠層中任何PH值下隨后離子：Gly-存在于電極緩沖液中pI=6.0pKα1=2.34pKα2=9.70在pH=6.7時，只有少數解離為Gly-，多數為Gly+-Pr分子在pH6.7時以Pr-形式存在聚丙烯酰胺凝膠電泳原理③pH的不連續(xù)性

pH大孔(濃縮)膠6.7小孔(分離)膠8.9緩沖液8.3聚丙烯酰胺凝膠電泳原理樣品濃縮效應（不連續(xù)性）

不連續(xù)性可控制Gly的解離度，從而控制有效遷移率

遷移率:Cl->Pr->Gly-(Pr被壓成薄層)

在大孔膠中：要求Gly的有效遷移率低于所有Pr，經計算pH=6.7在小孔膠中：要求Gly超過所有Pr，Pr留在后面進行普通的電泳與分子篩分離分成多個區(qū)帶(此pH實測為9.5)電泳過程示意圖

A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子

B顯示電泳開始后，蛋白質樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶

C顯示蛋白質樣品分離成數個區(qū)帶聚丙烯酰胺凝膠電泳原理不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應示意圖

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原理三種物理效率使樣品分離效果好，分辨率高

⑴一般電泳分離的電荷效應帶電多，MW小，遷移快

⑵不連續(xù)系統(tǒng)對樣品的濃縮效應遷移率被壓成薄層

⑶凝膠對樣品分子的篩選效應SDS測定蛋白質分子量原理

蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素1967年，Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS），則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關SDS測定蛋白質分子量原理

蛋白質Pr溶液中加巰基乙醇加SDS,打開氫鍵與疏水鍵復合物1.4g：1g加入SDS為SO4-2改變了Pr的荷電性質.SDS測定蛋白質分子量SDS測定蛋白質分子量SDS測定蛋白質分子量原理

各種SDS-Pr均帶相同密度的負電荷，其荷電超過了原Pr，消除了不同Pr荷電差異。加入SDS，改變了Pr的構象，SDS-Pr為長橢圓棒，各種短軸約為1.8nm。長軸：Mr，均呈正比例，所以常數斜率遷移率SDS測定蛋白質分子量原理

相對遷移率mR=樣品遷移距離cm/染料遷移距離cm標準曲線MW=K（10―bm）1gMW=1gK―bmR=K1―bmR

式中：MW為蛋白質的分子量；K，K1為常數；b為斜率；mR為相對遷移率標準蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數與多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量相對遷移率1D-SDS分離局限性分離度相當有限顯示含有單一蛋白質的條帶實際可能含有多種蛋白質分子一個純化的蛋白質可能含有多種蛋白質形式1D-SDS分析看上去純凈的單一條帶，相同樣品的2D-SDS可將相同分子質量條帶分解成具有不同等電點的多點反應了蛋白質的翻譯后修飾，化學修飾幾乎不影響SDS結合或在PAGE上的遷移二維電泳技術Smithies和Poulik（1956年）最早引入二維電泳技術：將紙電泳和淀粉凝膠電泳結合分離血清蛋白質O’Farrell發(fā)明的二維電泳體系根據蛋白質的兩個一級屬性：等電點和相對分子質量的特異性將蛋白質混合物在第一個方向上按照等電點高低進行分離（等電聚焦），在第二個方向上按照相對分子質量大小進行分離（SDS）二維電泳技術二維電泳分離后的蛋白質經顯色方法（考馬斯亮藍染色、酸性銀染、堿性銀染、負性染色、熒光染色、放射性標記）處理后，通過圖像掃描存檔，最后呈現(xiàn)出來的是在二維方向排列的呈“滿天星”狀排列的小圓的，其中每一個點代表一個蛋白質第二節(jié)一維等電聚焦電泳一、IEF凝膠制備一維等電聚焦的基本原理：

把蛋白質加入到含有pH梯度的載體時，如果蛋白質所在的點的pH值與其等電點不符，則該蛋白質會帶一定量的正電荷或負電荷。在高于其等電點的位置，蛋白質帶負電，反之帶正電。此時，如果加以強電場，蛋白分子會在電場作用下分別向正極或負極漂移。當達到其等電點位置時，蛋白質不帶電，就不再漂移，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。一、IEF凝膠的制備早期的等電聚焦以低濃度的聚丙烯酰胺凝膠為介質，在外加電場的該介質中，連續(xù)排列著從正極到負極pI值逐漸增加的合成載體兩性電解質(sythetic

carrier

ampholyte，SCA)當電壓加在SCA混合物間，最高pI值的分子（帶最多正電荷）移向負極，最低pI值（帶最多負電荷）的分子移向正極，其余分子將根據其pI值在兩個極值之間分散，從而形成一個連續(xù)的pH梯度等電聚焦電泳合成載體兩性電解質(1)易溶于水，在pI處應有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質或其它兩性電解質改變pH梯度；(2)在pI處應有良好的電導及相同的電導系數，以保持均勻的電場；(3)分子量小，可通過透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開；(4)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，也無變性作用，其化學組成不同于蛋白質。SCA的缺陷：SCA本身就是通過復雜的合成過程得到的，其重復性很難控制，這樣從一開始就限制了2-DE分離的重復性；SCA分子相對較小，難以在IEF膠內固定，在IEF過程中由水合正離子引起的電滲流將致使SCA分子向負極遷移（負極漂移），導致pH值不穩(wěn)定性增加。當利用管狀IEF膠時，由于玻璃毛細管壁的硅羥基帶負電，與這些負電荷基團對應，將在管膠表面聚集一層正電荷形成雙電層，這種作用加劇了負極漂移；SCA的缺陷：負極漂移作用對堿性區(qū)蛋白質的影響尤其嚴重，結果常導致堿性區(qū)蛋白質難以成功聚焦甚至導致區(qū)蛋白質的丟失每一次灌制SCA凝膠的重復性難以控制，凝膠的機械穩(wěn)定性差，易拉伸變形或斷裂，導致重復性的減低固相pH梯度（IPG）技術IPG通過immobiline共價偶聯(lián)于丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復性

IPG膠條分為線性和非線性線性是指膠條的pH均勻分布非線性是指為了突出某一pH范圍的結果，該pH值范圍的膠條長度有所增加商品化的IPG膠條IPG膠條的pH值范圍的選擇一般遵循以下原則：

①pH3~10線性梯度膠適于了解樣本中所有蛋白質的分布情況②pH3~10非線性梯度膠能提高pH5~7之間的樣本蛋白質解析度③聯(lián)合使用pH4~7和pH6~11梯度膠可獲得相關pH范圍的更清晰的蛋白質分布情況④小pH范圍梯度膠(pH3.5~4.5，pH4.5~5.5，pH5~6等)可提供高分辨率的蛋白質分布圖譜

二、加樣在高質量的凝膠基礎上進行加樣，有兩種方案：IPG膠重泡脹后，利用加樣杯，邊運行等電聚焦，邊上樣；利用加樣杯上樣的好處是在于加樣量可以提高很多，由于加樣杯直接和膠面接觸，使得分子量大于100000Da的蛋白質可以有效地進入IPG膠條容易在上樣處形成蛋白質沉淀，蛋白質樣品易滲漏

二、加樣另一種方案是將樣品與重泡脹液混合，在IPG膠條泡脹的同時樣品也滲入膠條，然后再加電壓，即膠內泡脹法其優(yōu)點是泡脹和等電聚焦整合為一程序即可完成，高效和高可重復性，是目前常用的加樣方法因需要泡漲過夜，故蛋白質可能發(fā)生溶解或修飾加樣量過大三、運行重泡脹完成后，可以加電壓開始IEF由于膠條所能承受的電流有限，IEF過程中要避免電流過大，一般限流為50μA最初樣品中離子強度高電壓應限制于200V、30min，逐步增壓，最終電壓至8000V并恒定運行若干小時運行時間決定于幾個不同因素：樣品類型、蛋白上樣量、IPG膠條長度、所用pH梯度三、運行獲得最好圖譜質量和所需最佳時間是IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間聚焦時間短，導致水平和垂直條紋過度聚焦：活性水轉運而導致過多水在IPG膠表面滲出（電滲），會造成蛋白圖譜變形在膠條堿性端產生水平條紋以及蛋白質丟失溫度低尿素會結晶，IEF應當在20℃運行沒有完全聚焦或聚焦時間不夠四、IPG膠條的平衡IPG膠條平衡兩次，每次15分鐘第一步的平衡液50mmol/LTris緩沖液（pH8.8）,含2%SDS、20mmol/LDTT、6mol/L尿素、30％甘油使一向膠條上的蛋白質變性SDS：與蛋白定量結合蛋白質:SDS＝1：1.4四、IPG膠條的平衡尿素，甘油：去除蛋白的高級結構以及亞基間的相互作用減少電內滲，有利于蛋白從第一向到第二向的轉移DTT使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)四、IPG膠條的平衡第二步平衡液中加入碘乙酰胺以取代DTT使蛋白質巰基烷基化，防止它們在電泳過程中重新氧化碘乙酰胺并且能使殘留的DTT烷基化(銀染過程中，DTT會導致點拖尾“pointstreaking”)將IPG膠條輕輕潤洗，并