第五章基因的分離與鑒定1

基因的分離與鑒定DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離重組體DNA分子的構(gòu)建及導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案克隆基因的分離重組子的選擇與鑒定克隆的概念

克隆,是英文Clone的音譯,它是由一個個體經(jīng)無性繁殖所產(chǎn)生后代的總稱，也可以是指用其它方式產(chǎn)生無性繁殖后代的技術(shù)。有兩個缺一不可的特征：既是無性生殖，又是遺傳同質(zhì)（相同的遺傳物質(zhì)）。一、目的基因的分離1.從生物基因組分離目的基因利用基因文庫篩選目的基因基因組文庫、cDNA文庫利用mRNA或cDNA釣取目的基因2.利用基因表達(dá)產(chǎn)物來獲取目的基因使用探針從cDNA文庫中篩選目的基因3.用酶學(xué)或化學(xué)方法合成目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶法合成目的基因PCR法合成目的基因化學(xué)合成目的基因胰島素基因、干擾素基因等市場化二、目的基因的來源1.基因組DNA的非特異性斷裂2.染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解3.通過mRNA合成cDNA4.人工體外合成DNA片段5.PCR擴(kuò)增特異性基因片段三、DNA克隆片段分離的方法1.利用限制性內(nèi)切酶片段化基因組DNA鳥槍法（shotgunapproch）：用限制性內(nèi)切酶消化給體基因組DNA，這種消化產(chǎn)物，不經(jīng)過凝膠電泳分部分離，就直接用來同載體分子作連接反應(yīng)的克隆方法。2.凝膠電泳法和蔗糖梯度離心法分離重組DNA分子的構(gòu)建構(gòu)建重組DNA分子的途徑重組子分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)化（transformation）：

將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。轉(zhuǎn)化的方法：化學(xué)的方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells):

受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)：

Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液懸浮菌體，離心用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時，備用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：取100μl

感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng

載體的重組DNA連接液，混勻冰浴放置半小時在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時（擴(kuò)增）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑細(xì)菌原生質(zhì)體的制備取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個原生質(zhì)體），加入10-20μlDNA重組連接液，同時加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長出細(xì)胞壁。在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化

在高壓電場下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染

是指轉(zhuǎn)化感染（Transfection來自于transfomation與infection）凡是以噬菌體（如M13）或病毒為載體，以轉(zhuǎn)化的方法將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法均稱為轉(zhuǎn)染。因此轉(zhuǎn)染就方法來說與轉(zhuǎn)化是一樣的。將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2小時，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)體外包裝顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)

將重組的λ噬菌體DNA或重組的柯斯載體DNA經(jīng)體外包裝成具有感染能體力的λ噬菌體顆粒，然后經(jīng)由在受體細(xì)胞表面上的λDNA接受位點(diǎn)，使這些帶有目的基因序列的重組體DNA注入大腸桿菌。轉(zhuǎn)化率的定義：轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個受體細(xì)胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長）轉(zhuǎn)化率例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個分子（6.02X1017

/2686X660），也就是說，每3400個pUC18分子才有一個分子進(jìn)入受體細(xì)胞另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個細(xì)胞只有一個細(xì)胞能接納pUC18DNA利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/μg載體，經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個重組克隆需要：104

/107

X10-2

==0.1μg載體DNA考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：0.1/20%=0.5μg載體DNA載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5μg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化率的用途載體及DNA重組分子方面：載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級插入片段的大?。簩|(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細(xì)胞方面：受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高轉(zhuǎn)化方法方面：受體細(xì)胞的預(yù)處理：影響最大供受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個原生質(zhì)體50ngDNA轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106

-107

/μgDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105

-106

/μgDNAλ-DNA轉(zhuǎn)染107

-108

/μgDNA電穿孔轉(zhuǎn)化106-109

/μgDNA擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個小時原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程λ噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定擴(kuò)增操作的目的1.基因文庫的構(gòu)建2.cDNA基因克隆3.基因組DNA克隆4.基因定位克隆

基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)?；蛭膸欤╣enelibrary）：用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機(jī)地連接在載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個片段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因文庫。同一定義也適用于線粒體或葉綠體ＤＮＡ的基因文庫。由于制備ＤＮＡ片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的ＤＮＡ片段即可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近ＤＮＡ順序。

基因文庫的構(gòu)建就是利用所謂的“鳥搶法”，使基因組的DNA片段隨機(jī)地插入適當(dāng)?shù)妮d體中，引入細(xì)胞進(jìn)行大量繁殖而構(gòu)建的。鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）鳥槍法操作的改進(jìn)使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率在連接前將DNA片段進(jìn)行分級分離凝膠DNA片段回收技術(shù)工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)鳥槍法克隆目的基因的局限性基因庫（genepool）

特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫（genelibraryorgenebank）

從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：

基因組文庫（含有全部基因）

cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率(一般期望99%)f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小例如，人的單倍體DNA總長為2..9x109

bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克??；而當(dāng)完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆基因文庫的完備性Forexample:期望值為0.99，插入片斷為20kb的

E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因組的克隆數(shù)的計算N

E.coli==1.1×103ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]這個例子說明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫，只需要幾千個克??；而真核生物則需要更大承載能力的載體。除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高基因組DNA的制備用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100kb左右。如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！載體和受體的選擇為了壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的λ-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒15kbλ-DNA25kb考斯質(zhì)粒45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟從基因文庫中篩選目的基因從基因文庫中篩選目的基因基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！！！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團(tuán)用TdT酶在DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端cDNA基因克隆cDNAlibrariescDNA基因克隆

cDNA文庫是指得到足夠多的分別克隆的cDNA片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各種mRNA的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的cDNA文庫。

cDNAlibrariesmRNAisolation,purificationChecktheRNAintegrity

FractionateandenrichmRNA

SynthesisofcDNA

TreatmentofcDNAends

LigationtovectorcDNA文庫特點(diǎn)沒有原核生物的cDNA

文庫原核生物的mRNA非常不穩(wěn)定；原核生物的基因組文庫比較容易構(gòu)建，能包含所有基因的序列。cDNA

文庫對于真核生物的基因分析cDNA文庫是只含有編碼蛋白的基因文庫cDNAs

沒有內(nèi)含子基因可以在E.coli

中直接表達(dá)用于新基因的鑒別組織或特殊類型細(xì)胞（基因的特異表達(dá)）cDNA文庫-mRNA分離

大部分真核生物的mRNAs有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補(bǔ)，由此來獲得mRNA.AAAAAAAAAAn5’cap用纖維素純化poly(A)mRNA的流程圖方法:mRNA的翻譯:用體外蛋白質(zhì)合成檢測mRNAs。（麥胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯體系或兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系）通過凝膠電泳分析mRNAs:用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳cDNA文庫-檢測mRNA的完整性確定mRNA沒被降解克隆特殊的mRNAs克隆一個特殊的基因比建立完整的cDNA文庫更有用凝膠分離:通過瓊脂糖凝膠電泳回收mRNAs（根據(jù)mRNA的大小）富集:通過雜交來實(shí)現(xiàn)cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA第一鏈的合成G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’引物退火mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPG5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTp5’自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失cDNA第二鏈的合成G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’NaOH煮沸TTTTTTTTTp5’OH3’KlenowdNTPsTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAOH3’S1AAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失cDNA第二鏈的合成G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’RNaseHDNApoldNTPTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTp5’S1T4DNAligaseTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAOH3’引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列cDNA第二鏈的合成核酸末端轉(zhuǎn)移酶G5’PPP’5GAAAAAOH3’TTTTTTp5’TdTdCTPG5’PPP’5GAAAAACCCCCCOH3’CCCCCC3’OHTTTTTp5’NaOHTTTTTp5’CCCCCC3’OH退火TTTTTp5’CCCCCC3’OH5P’GGGGGGklenowdNTPsTTTTTp5’CCCCCC3’OH5P’GGGGGGAAAAAOH3’對cDNA末端的處理平末端的片斷需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能進(jìn)行克隆步驟:移去突出的3’-ends(strand-specialnuclease)填充缺失3’核苷酸

(klenowfragmentofDNApolyIand4dNTPs)銜接物和平末端的連接(T4DNAligase)限制性內(nèi)切酶的消化

(E.coRI)與載體的連接

任何一個含有E.coRI酶切位點(diǎn)的載體都可以用來克隆cDNA步驟:載體末端脫磷酸（堿性磷酸酶）用T4DNA連接酶連接載體和cDNA(plasmidorlphagevector)提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等

cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序cDNA法分離目的基因的基本程序提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆。如血紅蛋白基因等特異分離程序利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序差異分離程序多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞正常的FR3T3細(xì)胞提取mRNA總mRNA共價交聯(lián)提取mRNA總mRNA合成cDNAcDNA合成第二鏈單鏈cDNA克隆原位雜交病毒誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA克隆上柱雙鏈cDNA1.以mRNA為材料；

（一些RNA病毒，不經(jīng)過DNA中間體，對其研究，cDNA是唯一可行的方法）2.與基因文庫的篩選比較，更簡單易行；3.由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低；4.克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因，用作基因序列的測定和發(fā)育過程中或組織中基因特異表達(dá)

cDNA克隆的優(yōu)越性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短

mRNA在細(xì)胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因cDNA法克隆目的基因的局限性基因組DNA克隆

Genomiclibraries基因組DNA文庫純化基因組DNA

基因組DNA的片斷化物理切割和限制性內(nèi)切酶eukaryotesprokaryotes與載體連接

構(gòu)建基因文庫的基因組DNA必須進(jìn)行純化后，才能用來制備適用于載體插入片斷大小的隨機(jī)片斷基因組DNA的純化

原核生物:直接從細(xì)胞中體取基因組DNA去除蛋白（蛋白酶消化）,脂類和其它“雜質(zhì)”。真核生物

:從細(xì)胞核中Hae

：5’-

…GG

/CC…

3’,

Sau3A:5’-/GATC-3’,

Alu:5’-

…AG/CT…3’,

BamH1:5’-G/GATCC限制性內(nèi)切酶消化將片斷的末端(粘性或平頭)和酶消化的載體連接酶切位點(diǎn)是否被修飾內(nèi)切酶消化的時間和用量取決于要插入片斷的大小范圍。載體選擇根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體構(gòu)建DNA文庫

載體

PlasmidphageλcosmidBACYAC

插入片斷

(kb)

5