血凝抑制實(shí)驗(yàn)在雞病診斷中的應(yīng)用

血凝抑制實(shí)驗(yàn)在雞病診斷中的應(yīng)用

1海相基因成分和血凝抑制實(shí)驗(yàn)一些鳥(niǎo)類(lèi)疾病，如新城病毒、流感病毒、傳染性支氣管炎病毒（經(jīng)濃縮和酶處理后）、127株腺體疾病患者和一些支流正在儲(chǔ)存紅細(xì)胞（血凝素-神經(jīng)酸酶hn蛋白與紅細(xì)胞表面受體結(jié)合）。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制,即血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)。用該實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)雞體注苗后抗體應(yīng)答水平及證實(shí)是否曾受感染。HI實(shí)驗(yàn)的基本成分是血凝(HA)抗原,系列稀釋的血清和紅細(xì)胞懸液(0.5%～1.0%)。實(shí)驗(yàn)可在小試管或微量板(96孔V型板)中進(jìn)行。生產(chǎn)中一般多用固定抗原稀釋血清法(β-法),而很少用固定血清稀釋抗原法(α-法)。HA抗原可從供應(yīng)商處購(gòu)得(如哈獸研,中監(jiān)所),也可自制。HI實(shí)驗(yàn)每孔使用血凝單位因抗原不同而各異:新城疫(ND)用8～10個(gè)或4個(gè)HA單位,流感(AI)用4個(gè)或2個(gè)HA單位,支原體用2～4個(gè)HA單位,腺病毒(EDS-76)用8～10個(gè)HA單位(美國(guó)禽病學(xué)家協(xié)會(huì)推薦),生產(chǎn)中常用4個(gè)HA單位,實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)先測(cè)定抗原HA單位,再稀釋至所需工作用HA單位。HI實(shí)驗(yàn)中,HA抗原濃度會(huì)影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但HA單位較細(xì)小的差別對(duì)被檢血清HI效價(jià)影響不大。一般情況下,增加HA抗原濃度會(huì)降低HI反應(yīng)敏感性,而減少HA抗原濃度可提高敏感性。即工作抗原效價(jià)過(guò)高測(cè)定抗體效價(jià)偏低,工作抗原效價(jià)過(guò)低,測(cè)定抗體效價(jià)偏高。血凝實(shí)驗(yàn)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于病毒的分離、鑒定、分型;測(cè)定抗體、抗原及免疫鑒定。2離心前后的血清用于分離血清的血液必須是新鮮無(wú)污染。將血液放入硅化管或一次性塑料離心管內(nèi),水平放置于37℃環(huán)境下數(shù)小時(shí),再用離心機(jī)8000～10000r/min離心3～5min,將析出的血清移入清潔的包裝內(nèi)備用。3胞懸液濃度對(duì)抗體效價(jià)的影響若供體雞是經(jīng)檢驗(yàn)符合要求的,可從單只雞體采集紅細(xì)胞,否則建議用3只以上雞的血液混合制備紅細(xì)胞懸液。有抗體雞提供的紅細(xì)胞需要更多次的洗滌(5遍以上),但應(yīng)注意有時(shí)不同的雞提供的紅細(xì)胞懸液對(duì)禽流感H5亞型的抗體測(cè)定效價(jià)差異很大,并且紅細(xì)胞懸液濃度對(duì)抗體效價(jià)也有影響,一般取0.5%～1.0%,大于1%時(shí)血凝價(jià)會(huì)降低,血凝抑制價(jià)會(huì)偏高;小于0.5%時(shí)血凝價(jià)偏高,血凝抑制價(jià)偏低。采血時(shí)先將注射器內(nèi)吸入3.8%～4.0%枸櫞酸鈉(1份抗凝液可抗凝4份血液)或阿氏液(抗凝劑和血液等體積)再采血。采完后將抗凝劑和血液輕輕搖勻,再注入大離心管內(nèi)加生理鹽水洗滌,洗滌按2500～3000r/min離心3～5次,每次離心后棄掉上清液和白細(xì)胞層,保留紅細(xì)胞層。洗滌完畢,用生理鹽水稀釋成0.5%～1.0%紅細(xì)胞懸液。配好的紅細(xì)胞懸液要做血球沉淀檢查:取96孔V型板一塊,滴1滴紅細(xì)胞懸液到任意孔內(nèi),室溫靜置20～40min,查看血球沉淀情況,決定是否能用。如血球沉淀檢查合格,則該批紅細(xì)胞懸液應(yīng)在24h內(nèi)用完,如過(guò)夜應(yīng)再離心洗滌1～2次。4血液抑制和血液抑制的具體操作過(guò)程h-法4.1ha體驗(yàn)(1)96個(gè)v型板，25μL/孔加生理鹽水。(2)孔1μL抗原。(3)將倍比稀釋至11個(gè)孔，稀釋25個(gè)孔μL,第12孔作對(duì)照。(4)每個(gè)孔加入25克生理鹽水μL。(注)(5)每個(gè)孔加入25克紅細(xì)胞懸液μL。(6)振動(dòng)室，20.40min。(7)記錄結(jié)果(注):該方法中第二次加生理鹽水是為讓HA實(shí)驗(yàn)與HI實(shí)驗(yàn)每孔中液體量相等,以保持抗原濃度相等。4.2紅細(xì)胞懸液的制備(1)依據(jù)抗原類(lèi)型及HA實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制工作抗原。(2)于96孔V型板中按加25μL/孔生理鹽水到1～12孔。(3)第一孔加25μL待檢血清。(4)倍比稀釋至第10孔,棄掉25μL。(5)加工作抗原25μL/孔至第1～11孔。(6)振蕩1min室溫靜置20min。(7)于96孔V型板內(nèi)按每孔加25μL紅細(xì)胞懸液。(8)振蕩1min室溫靜置20～40min。(9)記錄結(jié)果。4.3影響ha和hi測(cè)試結(jié)果的因素(1)試驗(yàn)所需的設(shè)備應(yīng)清潔特別是96孔V型板,內(nèi)壁不僅要求干凈,還要求光滑無(wú)劃痕、破損。(2)紅細(xì)胞懸液質(zhì)量見(jiàn)上述“紅細(xì)胞懸液”。(3)抵抗抗原不能反復(fù)凍融,每批抗原每次使用前都要用陽(yáng)性、陰性血清檢測(cè)一次。其它注意事項(xiàng)見(jiàn)上述“HA抗原”。(4)紅細(xì)胞吸附法A.56℃30min滅活:所有待檢血清放在56℃水浴鍋中作用30min。B.紅細(xì)胞吸附:取20%～50%紅血球加入待檢血清37℃作用30min離心,取上清液為待檢血清。C.用化學(xué)試劑:10%～50%高嶺土放入待檢血清,作用一段時(shí)間,離心取上清液。(5)抗原劑和抗原劑的反應(yīng)時(shí)間很長(zhǎng)時(shí)間過(guò)短出現(xiàn)凝集不完全,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象。(6)對(duì)照孔凝集物的測(cè)定A.HA試驗(yàn):以紅細(xì)胞對(duì)照完全沉淀為標(biāo)準(zhǔn),一般在室溫條件下20～45min出結(jié)果。B.HI試驗(yàn):抗原對(duì)照孔出現(xiàn)完全凝集,生理鹽水對(duì)照孔出現(xiàn)完全沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。一般在室溫條件下20～45min出結(jié)果。(7)正確的溫度一般室溫條件下溫度偏高出結(jié)果快一點(diǎn),偏低出結(jié)果慢一點(diǎn),但當(dāng)試驗(yàn)溫度低于4℃時(shí),紅細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。(8)權(quán)插液液配制A.倍比稀釋次數(shù),一般取8～16次。B.稀釋時(shí),滴頭不能垂直插在孔底,應(yīng)稍斜一下;滴頭不能離開(kāi)液面,以免產(chǎn)生氣泡;最后一次稀釋時(shí)應(yīng)將滴頭內(nèi)的液體完全排空(移液器第二檔),再吸取液體移至下一孔。C.加樣:除第一次加生理鹽水并稀釋完抗原(抗體)后,再加其它液體時(shí)應(yīng)先加對(duì)照孔,再?gòu)牡蜐舛认蚋邼舛燃?加樣時(shí)滴頭可貼在孔壁上緣,但不能接觸液面;加紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)邊加邊搖晃盛紅細(xì)胞懸液的容器。4.4hi測(cè)試中的錯(cuò)誤(1)鹽水的細(xì)菌凈化A.鹽類(lèi)凝集:稀釋液中NaCl達(dá)到一定濃度時(shí),即使沒(méi)有血清抗體也能發(fā)生凝集。B.當(dāng)生理鹽水被細(xì)菌污染時(shí),也可能出現(xiàn)對(duì)照孔凝集。C